化妆品中绿脓杆菌标准检验

         绿脓杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出绿脓杆菌。  

         1 方法提要
         根据本菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在电热恒温培养箱42℃条件下生长等，可与类似菌相区别。
         2 培养基和试剂
         2.1 SCDLP 液体培养基
见GB 7918.1-87《化妆品微生物标准检验方法 总则》。
         2.2 十六烷*基溴化铵培养基
成分： C8H9Cl                  3g
蛋白胨                  10g
氯化钠                  5g
十六烷*基溴化铵         0.3g
琼脂                       20g
蒸馏水                    1000ml
制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4～7.6，加入琼脂，115℃(10 1b)20min灭菌后，制成平板备用。
         2.3 乙酰胺培养基
成分：乙酰胺                10.0g
氯化钠                       5.0g
无水磷酸氢于钾             1.39g
无水磷酸二氢钾             0.73g
硫酸镁(MgSO4·7H2O)            0.5g
酚红                       0.012g
琼脂                          20g
蒸馏水                     1000ml
制法：除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，121℃(15 1b)20min高压灭菌后，制成平板备用。
         2.4 绿脓菌色素测定用培养基
成分： 蛋白胨            20g
氯化镁                  1.4g
硫酸钾                   10g
琼脂                     18g
甘油(化学纯)             10g
蒸馏水                1000ml
制法：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115℃(10 1b)20min高压灭菌后，制成斜面备用。
         2.5 明胶培养基
成分： C8H9Cl             3g
蛋白胨                    5g
明胶                    120g
蒸馏水                1000ml
制法：取各成分加在蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经115℃(10 1b)20min灭菌后，直立制成高层备用。
         2.6 硝酸盐蛋白胨水培养基
成分： 蛋白胨           10g
酵母浸膏                 3g
硝酸钾                   2g
亚硝酸钠               0.5g
蒸馏水               1000ml
制法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115℃(10 1b)20min灭菌后备用。
         2.7 普通琼脂斜面培养基
成分：蛋白胨           10g
C8H9Cl                   3g
氯化钠                   5g
琼脂                    15g
蒸馏水               1000ml
制法：除琼脂，将其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为7.2～7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，121℃(15 1b)15min高压灭菌后，制成斜面备用。
         ３ 仪器
3.1 恒温培养箱：37℃、42℃。
3.2 锥形烧瓶。
3.3 试管。
3.4 灭菌平皿。
3.5 灭菌刻度吸管。
3.6 显微镜。
3.7 载玻片。
3.8 接种针、接种环。
3.9 电炉。
3.10 高压消毒锅。
         4 操作步骤
         4.1 增菌培养：取1：10样品稀释液10ml加到90ml SCDLP液体培养基中，置37℃培养18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
注：如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基。检验含防腐剂的化妆品时，在每1000ml普通肉汤中加1g卵磷脂、7g吐温80。
         4.2 分离培养：从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷*基溴化铵琼脂平板上，置恒温培养箱37℃培养18～24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无守型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。
在缺乏十六烷*基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平皿中，放37℃培养24H，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带红色，其他菌不生长。
         4.3 染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
         4.4 氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基对苯二胺试液，在15～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性。
         4.5 绿脓菌素试验：取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置37℃培养24h，加入CHCl33～5ml，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于CHCl3液内，待CHCl3提取液呈蓝色时，用吸管将CHCl3移到另一试管中并加入1N的盐酸1ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。
         4.6 硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
         4.7 明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置37℃培养24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。
4.8 42℃生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41～42℃恒温培养箱中，培养24～48h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
         5 检验结果报告
被检样品增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和４２℃生长试验三者皆为陧性时，仍可报告被检样品中有绿脓杆菌。