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霉菌酵母菌的计数
发布时间:2019-05-21   点击次数:74次

        一、真菌和酵母的介绍

        酵母是真菌中的一大类,通常是单细胞,呈圆形、卵圆形、腊肠形或杆状。

        霉菌也是真菌的一种。一般把能够形成疏松的绒毛状菌丝体的小型真菌称为霉菌。

        霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来,人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品,如用霉菌加工干酪和肉,使其味道鲜美;还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱;食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。

        但在某些情况下,霉菌和酵母也可造成食品变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强,故常常在不适于细菌生长的食品中出现,这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品,含有抗菌素的食品等 。由于霉菌和酵母能抵抗冷冻,以及抗生素和辐照等贮藏及保藏技术,它们能转换某些不利于细菌的物质,而促进致病细菌的生长;有些霉菌能够合成有毒代谢产物-霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如,酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖,可使食品发生难闻的异味,它还可以使液体发生混浊,产生气泡,形成薄膜,改变颜色及散发不正常的气味等 。

        因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌,并以霉菌和酵母计数来表示食品被真菌污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。

        二、检验方法

        霉菌和酵母的计数方法,与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为:

        将样品制作成10倍梯度的稀释液,选择2~3个合适的稀释度,分别吸取1 mL于两个无菌平皿,倾注培养基,培养后观察,计数。

        对番茄酱、番茄汁适用于第二法 霉菌直接镜检计数法,是采用显微镜直接镜检计数的方法。这个方法表达的是该食品是否存在加工前的变质。

        具体检验方法标准按照:

        GB 4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》

        说 明

        ⒈样品的处理:为了准确测定霉菌和酵母数,真实反映被检食品的卫生质量,首先应注意样品的代表性。容易混匀的液体样品可用迅速振摇样品稀释液容器25次来混匀。

        对大的固体食品样品,要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料,再进行均质。如样品不太大,建议把全部样品放到拍击式均质器内均质1 min。由于霉菌丝状结构的特性,使用旋转刀均质器可能会导致较高的不真实计数结果。

        ⒉样品的稀释:限量值较严格的样品,可以直接取原液进行检验。为了减少稀释倍数的误差,在连续递增稀释时,每一稀释度应更换一根吸管。以前标准规定在稀释过程中,为了使霉菌的孢子充分散开,需用灭菌吸管反复吹吸50次。现在实验室条件较好,为了防止产生有害的气溶胶并且减少操作污染,一般建议使用旋涡混合仪来充分混匀稀释液。

        ⒊培养基的选择:在霉菌和酵母计数中,主要使用以下几种选择性培养基。

        马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时,必须加入抗菌素(国标使用的是氯霉素)以抑制细菌。但是这个培养基上霉菌容易蔓延生长,影响MAX后的计数。

        孟加拉红(虎红)培养基:该培养基中的孟加拉红可抑制霉菌菌落的蔓延生长。孟加拉红还在菌落背面由孟加拉红产生的更深的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。也需要加入抗菌素(国标使用的是氯霉素)抑制细菌的干扰。

        高盐察氏培养基:粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好,它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。现在仅限于饲料霉菌检验方法标准采用。

        ⒋倾注培养:每个样品应选择3个适宜的稀释度,每个稀释度分别取2个1 mL加入2个平皿。同时吸取1 mL无菌稀释液加入一个无菌平皿作为空白对照。培养基融化后冷却至46 ℃,立即倾注并旋转使稀释液与琼脂混匀,先向一个方向旋转,再转向相反方向,充分混合均匀。培养基凝固后,把平皿正置于恒温培养箱培养。大多数霉菌和酵母在中等温度的条件下生长良好,因此,美国FDA规定的培养温度是25℃,我国规定的培养温度是28 ℃。培养3 d后开始观察菌落生长情况,共培养5 d。观察第5天的计数结果,并记录。如空白对照有菌落出现。此次试验无效。

        ⒌菌落计数及报告:选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板,取两个平板菌落数的平均值,乘以稀释倍数报告。固体检样以g为单位报告,液体检样以mL单位报告。关于稀释倍数的选择可参考细菌菌落总数测定。

        ⒍霉菌直接镜检计数法:采用该方法,需要一片较为昂贵的霍华德霉菌计测片。没有这个玻璃片,无法进行这个直接镜检的方法。

        该方法将果酱或果汁稀释到一定波美度后,涂布在霍华德霉菌计测片上。然后在显微镜下观察,观察50个视野里面是否有霉菌。要求两个人进行此实验。以100个视野观察结果报告。

        霉菌菌丝的特征:

        平行壁:霉菌菌丝呈管状,多数情况下,整个菌丝的直径是一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来象两条平行的线。这是区别霉菌菌丝和其他纤维时MAX有用的特征之一。

        横隔:许多霉菌的菌丝具有横隔,仅有毛霉、根霉等少数霉菌的菌丝没有横隔。

        菌丝内呈粒状:薄壁、呈管状的菌丝含有原生质,在高倍显微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。

        分枝:如菌丝不太短,则多数呈分枝状,分枝与主干的直径几乎相同,有分枝是鉴定霉菌菌丝的可靠特征之一。

        菌丝的顶端:常呈钝圆形,无折射现象。

        凡有以上特征之一的丝状均可判定为霉菌菌丝。

        观察视野中有无菌丝,凡符合下列情况之一者为阳性视野。   

        一根菌丝长度加上分枝的长度超过视野直径1/6;

        一根菌丝长度超过视野直径1/6;   

        两根菌丝总长度超过视野直径1/6;  

        三根菌丝总长度超过视野直径1/6;  

        一丛菌丝可视为一个菌丝,所有菌丝(包括分枝)总长度超过视野直径1/6。

        根据对所有视野的观察结果,计算阳性视野所占比例,并以阳性视野百分数(%)报告结果。

        计算公式:

        每件样品阳性视野(%)=(阳性视野数 / 观察视野数)×100

 

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