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如何用二氧化碳培养箱进行细胞复苏、传代及冻存实验
发布时间:2018-03-07   点击次数:2705次

一  复苏 传代

(1) 准备

   无菌超净台,酒精灯,75%酒精喷壶,二氧化碳培养箱,37℃水浴锅,离心机;培养瓶,含10%胎牛血清的完全培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液(提前放置超净台使平衡到室温),无菌工作服(白大褂),口罩,手套,记号笔

(2) 步骤

   1.穿好无菌工作服,带上口罩和手套,快速从液氮里取出冻存管,快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻,注意冻存管的封口膜不要破裂,防止污染。

   2.解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴,酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。

   3.开超净台,点燃酒精灯燃烧片刻后(可提前准备),冻存管放超净台,换新手套,小心打开冻存管,避免污染,无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管,补加9ml基础培养基稀释,1000rpm,离心5min使细胞沉淀,弃上清。

   4.加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml,轻轻混匀,用吸管将细胞移至25T培养瓶。

   5.平躺放置培养瓶,8字形混匀后,置于37℃,5%二氧化碳培养箱培养。

   6.培养24小时后,显微镜观察细胞(贴壁细胞)贴壁后,小心更换培养基,根据不同细胞的生长状态进行传代培养,培养瓶上标记:操作者,时间,细胞类型。

   7.有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染,但是这对于掌握细胞培养是非常不利的,不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。一旦细胞出现污染,易于发现,一旦发现污染的细胞应立刻煮沸丢弃,以免污染同实验室其他细胞。

   8.细胞长满90%-100%即可传代,小心打开培养瓶,瓶口过酒精灯消毒,弃培养基。

   9.加入1mlPBS,润洗细胞,重复3次,弃PBS。

   10.加入4ml完全培养基,用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。

   11.转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶,各瓶补加完全培养基至4ml。

   12.小心封口,平躺放置培养瓶,8字形混匀后,置于37℃,5%二氧化碳培养箱培养。

   13.待长满后,按同样的方法传代培养。

二  冻存

当不需要使用细胞或者细胞量足够时,可以将细胞冻存起来,供以后实验用

(1) 准备

    细胞冻存液(20%血清、10%DMSO、70%基础培养液),梯度降温盒

(2) 步骤

        1.选取活力好,密度约70%细胞用于冻存,此时细胞处于对数生长期,zui适合用于冻存。

        2 .细胞吹打或者胰酶消化后,转移至无菌EP管,1000rpm里面5min。

        3.弃上清,加入新鲜配制的细胞冻存液,25T细胞可以加入2ml细胞冻存液,分装2个冻存管,细胞zui佳密度为5*106-1*107个每ml。

        4.做好标记,放入梯度降温盒(提前平衡至室温)。

        5.将梯度降温盒放入-80℃冰箱过夜,第二天取出冻存管,快速放入液氮保存。

 

遵循“快速复苏,缓慢冻存”的原则。

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