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细胞克隆实验
发布时间:2018-08-15   点击次数:536次

      随着二氧化碳培养箱的普及,现在用二氧化碳培养箱来做实验的人越来越多,下面喆图小编就给大家讲解一下细胞克隆的实验方法。
细胞克隆或集落的原理:
      当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆。每个克隆含有50以上的细胞,大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。克隆形成率反映细胞两个重要性状:细胞群体依赖性、增殖能力。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大:
a).初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;
b).二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;
c).正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。


      实验方法
1.平板集落形成实验:本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞。
注:适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。
2.软琼脂集落形成实验:本法适用于非锚着依赖性生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
注:正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验。

      实验步骤
一、平板克隆形成实验基本步骤:
1.取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2.将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。
3.经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10~30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。
4.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。后计算克隆形成率。
克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%
二、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤:
1.取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
2.用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固。
3.按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
4.按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37℃ 5%CO2温箱中培养10~14天。
5.把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数。计算形成率。 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞。


      注意事项
1.接种时细胞密度适度,不可过高。
2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃,否则将会烫伤/死细胞;
3.琼脂对热和酸不稳定,若反复加热,容易降解而产生毒性,且硬度下降。因此高压灭菌后应进行分装;
4.细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度,否则结果的准确度会受到很大影响;
5.细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养,生存率明显下降,永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上,但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%,甚至无法形成单个克隆。因此,为了提高克隆形成率,有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。
6.细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在碟皿中,持续一周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养。
详情可咨询上海喆图科学仪器有限公司。

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