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Transwell迁移/侵袭实验
发布时间:2019-03-12   点击次数:325次

 

        基本原理

        将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

        应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。侵袭实验中使用到的Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分,含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖,铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上,能在DMEM培养基中重建形成膜结构,这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

        Transwell小室的滤膜孔径一般为8μm,在侵袭实验中,膜孔都被Matrigel覆盖,细胞不能自由穿过,必须分泌水解酶,并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜,这与体内情况较为相似。细胞欲进入下室,先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解,方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

        所需材料

ØTranswell小室

Ø细胞生长培养基

Ø胎牛血清

Ø胰蛋白酶

ØPBS

Ø青霉素-链霉素溶液(100×)

Ø结晶紫或台盼蓝

Ø甲醇

ØMatrigel(侵袭实验)

        主要试剂配置

(1)PBS磷酸盐缓冲液: PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000ml,调pH7.2,121℃,30min,高压灭菌,4℃保存。

(2)细胞生长培养基:低温培养箱-20℃保存,临用前按体积比配成含10% FBS和1%青霉素-链霉素双抗的完全培养液。

        操作步骤

1.所有细胞培养试剂和细胞培养池放在电热恒温培养箱内37℃温育;

2.待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤1次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×105 /ml;

3.如进行侵袭实验,将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜,在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基稀释至300 μl/ml,取100 μl均匀涂抹一层于细胞培养池的PET膜上表面,然后将培养池轻轻放入24孔板孔内,37℃放置3 h左右,取出于超净工作台过夜干燥。

注:如进行迁移实验,则跳过这一步骤

4.在下室(即24孔板底部)加入600-800 μl 含10%血清的培养基,上室加入100-150 μl细胞悬液,继续在孵箱培养24 h;

5.将其下表面浸泡在70%甲醇溶液中,固定30 min~60 min,用结晶紫或台盼蓝染色,镜检,并计算PET膜下表面的细胞数,计算中间和四周5个视野,取平均值。

        实验结果

镜下对染色后的细胞进行计数,计数值高,则该组细胞迁移/侵袭能力强。

        以上设备详情,请咨询上海喆图。

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