简单的质粒DNA提取实验

        在我们的细胞实验中经常会用到质粒DNA，现在都用剂盒非常方便，而且菌体培养后，可以多管浓缩提取，提到的质粒量多，可以-20℃保存，以后用于酶切、转化等实验，可以提前跑个胶，只要不降解，就可以继续用，避免每次要用，都要培养一遍再提取一遍。

        质粒DNA的提取

        质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时MAX主要的DNA载体。

        实验步骤

        1.摇菌培养

1）将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。

2）置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。

3） 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。

4） 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。

5） 37℃，180rpm，振荡培养过夜。

        2.收获细菌并裂解

1） 离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。

2）用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。

3） 细菌高速离心1min,*去除上清。

4）加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。

5）加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。

6）加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。

7）室温，1500rpm，高速离心15min。

8）将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。

9）弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。

10）重复上一操作。

11）将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，加30-50ul预热的Elution Buffer，室温，放置2min，高速离心1min。

12）样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，MAX明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

        3.质粒的纯化

1）将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。

2）加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。

3）4℃，高速离心机14000rpm，离心20min.

4）弃去上清，70%乙醇洗2次。

5）空气干燥，可置超净工作台干燥。

6）加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。

7）紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。

测量OD260和OD280的值：质粒DNA浓度=OD260×50×稀释倍数（μg/mL）。

        10个常见问题

        一.时间控制问题

        裂解时间太长，加入溶液P2后裂解时间不应超过5 分钟；吸附时间不够；溶解时间不够都会导致质粒DNA提取实验失败。

        二.大肠杆菌老化

        建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

        三.质粒拷贝数低

        由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。

        四.溶液使用不当

        溶液P2、P3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃培养箱保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

        五.吸附柱过载

        不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB 或者 ×YT 菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB 培养液体积。

        六.质粒未全部溶解

        洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

        七.乙醇残留

        漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。

        八.洗脱液加入位置不正确

        洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会*覆盖硅胶膜的表面达到MAX大洗脱效率。

        九.洗脱液不合适

        DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱。洗脱效率取决于pH 值。MAX大洗脱效率在pH7.0～ 8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果pH 过低可能性导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脱效率。

        十.洗脱体积太小

        洗脱体积对来回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。