培养人多能干细胞

        人多能干细胞(hPSCs)因其拥有分化为机体所有类型细胞的能力，使得hPSCs成为研究发育机制以及疾病机理MAX常用的工具，同时在再生医学以及疾病治疗领域也有非常广泛应用。人类多能干细胞因其来源不同又可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）。

        小鼠胚胎干细胞由Martin Evans在1970年从小鼠胚囊中分离获得，小鼠胚胎干细胞就可以成功地在体外进行培养。人的胚胎干细胞的体外培养在1998年由美国科学家James Thomson培养成功。

        诱导多能干细胞是日本科学家山中伸弥（Shinay Yamanaka）团队在2006年利用病毒载体将Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc四个转录因子转入小鼠胚胎成纤维细胞重编程而成。iPS细胞在细胞形态、基因蛋白表达、表观遗传修饰以及畸胎瘤形成能力与胚胎干细胞非常相似。2007年11月，山中伸弥实验室成功将人皮肤纤维母细胞诱导成iPS细胞。2009年我国科学家周琪院士与曾凡一教授，利用iPS细胞，通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，世界上证明了iPS细胞的性。

        下面对多能干细胞不同培养体系以及传代方法进行分析：

        多能干细胞MAX常见的培养体系有可以分为有血清培养系统跟无血清培养系统：

        有血清系统为基础培养基配干细胞级血清，同时添加bFGF等生长因子，此方法对血清要求较高，在目前国内血清比较乱的情况下，购买的合格的血清是制约细胞培养的主要因素，同时该体系还需要滋养层细胞，培养方法较复杂。

        无血清干细胞培养系统发明大大简化了干细胞培养流程，目前常用的为Gibco Essential8培养基与Stemcell Technologies 的mTesR系统。两种系统均为无血清，不需要额外添加生长因子，同时摆脱了滋养层细胞的限制，通过包被培养板就可以达到细胞贴壁的目的。但是，以上两种培养基价格不菲，同时因为含有牛血清白蛋白（BSA）经常会有进口限制。以上产品也均有国内替代，Applied Cell分别有人多能干细胞培养基（适用于Essential8 系统），以及Advance 人多能干细胞培养基(适用于mTesR系统)。

        培养皿包被：目前有两种常见的包被方法，分别为Matrix基质胶包被以及 Vitronectin包被，以上两种胶对温度非常敏感，操作要求较高，需要全程低温操作，同时现配现用。针对以上问题现在多家公司均有有即用型基质胶（Gibco,Stemcell Tech,Applied Cell）推出。

        传代：干细胞传代经过多年发展也逐步简化，MAX初通过胶原酶消化，挑克隆法传代；后续发展出机械传代发，多家公司也推出了细胞切割工具；至目前已经可以做到使用消化液完成消化，消化液种类也多种多样，分别有Accutase,Tryple以及无酶消化液，均可以达到很好的传代效果。

        以下另附多能干细胞培养操作手册：

        人iPS/ES细胞复苏操作：

        人iPS/ES细胞的复苏标准操作包括实验前准备工作和实验过程中的具体操作，下面即人iPS/ES细胞的复苏标准操作：

        1. 实验前准备工作：

        1.1 基质胶铺板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，每孔内加入1 mL/0.5 mL即用型基质胶（AC-1001007），轻轻晃动6孔板/12孔板使基质胶*覆盖皿底，然后置于37℃，5% CO2培养箱中孵育1h~2h，在实验前拿出并置于超净工作台/生物安全柜中室温下平衡20min或2-8℃静置过夜备用。如果暂时不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 储存，并于1周内使用。

        注意：①干细胞复苏过程中的基质胶铺板数由冻存细胞密度决定，一支冻存的干细胞的密度在1×106cells/mL左右，需要6孔板铺1孔或12孔板铺2孔基质胶；②即用型基质胶受热易发生沉淀，即用即拿及时放回4℃冰箱保存且勿用手直接触碰基质胶液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影响基质胶质量。

        1.2 实验试剂平衡：人多能干细胞培养基（AC-1001000）在实验前置于室温中避光平衡30min~1h。

        1.3 超净工作台/生物安全柜照射紫外：在实验前打开紫外灯照射30min进行灭菌。

        1.4 恒温水浴锅准备：水浴锅温度设置在37℃用于hPSC细胞复苏。

        2. 实验具体操作步骤：

        2.1 提前加入人多能干细胞培养基（AC-1001000）：复苏前，先在15mL离心管中加入2~3mL的干细胞培养基备用。

        2.2 解冻：将从液氮中取出的冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1~2min内快速解冻；

        注意：细胞从液氮中拿出的速度要快，尽量减少其暴露在室温中的时间。

        2.3 离心：冻存管中的冻存液解冻后，将其吸出并缓慢逐滴滴入提前在15mL离心管中加入的干细胞条件培养基中，将15mL离心管置于低速离心机中配比平衡后，1000rpm/min离心3min；

        2.4 重悬：离心后弃上清加1mL人多能干细胞培养基（AC-1001000） 对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3~5次左右。

        2.5 接种：吹吸均匀后，将已经平衡好的即用型基质胶（AC-1001007）弃掉，缓慢吹吸15mL离心管中的细胞悬液，缓慢吹吸3~5次，待细胞悬液混匀后，加入到6孔板/12孔板中铺胶的孔内，且补全每孔2 mL/1 mL的培养体系。

        2.6 培养：接种后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差显微镜下观察接种的干细胞密度以及细胞团块大小，呈4个细胞以上的团块较合格，水平十字轻轻晃动6孔板/12孔板使细胞均匀分布。并置于37℃，5% CO2的恒温培养箱培养，第2天观察细胞贴壁情况；

        2.7 换液：从复苏的时间开始每24h换液一次。

        注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每24h应及时更换新鲜培养基。

        人iPS/ES细胞扩增操作：

        人iPS/ES细胞的扩增标准操作包括实验前准备工作和实验过程中的具体操作，下面即人iPS/ES细胞的扩增标准操作：

        1. 实验前准备工作：

        1.1 基质胶铺板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，根据细胞密度决定传代的孔数（细胞密度中等则可以按照1:2传代，密度大则按照1:3或4传代），并在每孔内加入 1 mL/0.5 mL即用型基质胶（AC-1001007），轻轻晃动6孔板/12孔板使基质胶*覆盖皿底，然后置于37℃，5% CO2培养箱中孵育1h~2h，在实验前拿出并置于超净工作台/生物安全柜中室温下平衡20min或2-8℃静置过夜备用。如果暂时不用，可用Parafilm封口后2-8℃ 储存，并于1周内使用。

        注意：①通常早代次(<10代)的干细胞需要以较低的比例传代，如1:2-1:3；成功建系的干细胞（10代以上）可以1:4-1:5的比例传代，传代的比例由细胞株的生长速率决定。比较理想的传代时间间隔是3-5天一次，刚刚复苏的细胞次传代时间一般是复苏后第5天。②即用型基质胶受热易发生沉淀，即用即拿及时放回4℃冰箱保存且勿用手直接触碰基质胶液面所及的瓶身，防止生成沉淀，影响基质胶质量。

        1.2 实验试剂平衡：人多能干细胞培养基（AC-1001000）、人多能干细胞消化液（AC-1001008 ）以及PBS缓冲液在实验前置于室温中避光平衡30min~1h。

        1.3 超净工作台/生物安全柜照射紫外：在实验前打开紫外灯照射30min进行灭菌。

        2. 实验具体操作步骤：

        2.1 清洗：拿出6孔板/12孔板弃去旧的人多能干细胞培养基（AC-1001000），贴壁缓慢加入1 mL/0.5 mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去 PBS缓冲液；

        2.2 消化：在6孔板/12孔板中加入1 mL/0.5 mL人多能干细胞消化液（AC-1001008）使之覆盖皿底，并置于CO2培养箱中2~5 min；

        注意：消化时间依据干细胞生长密度，如果密度中等且培养2~3天，消化时间可以控制在2 min~3min，若密度很大且培养4天以上消化时间可以控制在3 min~5min，消化时间快结束时可以拿到倒置显微镜下观察细胞消化情况，若在显微镜下观察到大部分克隆边缘以及克隆内部细胞间出现间隙，即刻吸掉无酶消化液停止消化。

        2.3 吹打：吸掉人多能干细胞消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的2mL/1mL干细胞培养基（AC-1001000），用移液枪扇形吹打培养皿底，吹吸次数保持在3~5次，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液，并将其并转移到15mL离心管中；

        注意：吹吸皿底细胞的力度要轻柔，吹打脱落和吹吸混匀的次数在3~5次为宜，尽量避免形成单细胞。如有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。

        2.4 接种：待皿底的细胞全部吹下并加入到15mL离心管后，将已经平衡好的即用型基质胶（AC-      1001007）弃掉，缓慢吹吸15mL离心管中的细胞悬液，缓慢吹吸1~2次，待细胞悬液混匀后，加入到6孔板/12孔板中铺胶的孔内，且补全每孔2mL/1mL的培养体系。

        2.5 培养：接种后的6孔板/12孔板可以置于倒置相差显微镜下观察接种的干细胞密度以及细胞团块大小，呈4个细胞以上的团块较合格，水平十字轻轻晃动6孔板/12孔板使细胞均匀分布。并置于37℃，5% CO2恒温培养箱培养，第2天观察细胞贴壁情况；

        2.6 换液：从传代的时间开始每24h换液一次。

        注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每24h应及时更换新鲜培养基。

        人iPS/ES细胞冻存操作：

        人iPS/ES细胞的冻存标准操作包括实验前准备工作和实验过程中的具体操作，下面即人iPS/ES细胞的冻存标准操作：

        1. 实验前准备工作：

        1.1 实验试剂平衡： 人多能干细胞培养基（AC-1001000）、人多能干细胞消化液（AC-1001008）以及PBS缓冲液在实验前置于室温中避光平衡30min~1h。

        1.2 超净工作台/生物安全柜照射紫外：在实验前打开紫外灯照射30min进行灭菌。

        2. 实验具体操作步骤：

        2.1 清洗：拿出6孔板/12孔板弃去旧的人多能干细胞培养基（AC-1001000），贴壁缓慢加入2mL/1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去 PBS缓冲液；

        2.2 消化：在6孔板/12孔板中加入2mL/1mL人多能干细胞消化液（AC-1001008）使之覆盖皿底，并置于CO2培养箱中 2~5min；

        注意：消化时间依据干细胞生长密度，如果密度中等且培养2~3天，消化时间可以控制在2 min~3min，若密度很大且培养4天以上消化时间可以控制在3 min~5min ，消化时间快结束时可以拿到倒置显微镜下观察细胞消化情况，若在显微镜下观察到大部分克隆边缘以及克隆内部细胞间出现间隙，即刻吸掉无酶消化液停止消化。

        2.3 吹打：吸掉人多能干细胞消化液（AC-1001008）后，立刻加入平衡好的 1~2 mL人多能干细胞培养基（AC-1001000），用移液枪扇形吹打培养皿底，吹吸次数保持在3~5次，使皿底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液，并将其并转移到15mL离心管中；

        注意：吹吸皿底细胞的力度要轻柔，吹打脱落和吹吸混匀的次数在3~5次为宜，尽量避免形成单细胞。如有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。

        2.4 离心：待皿底的细胞全部吹下并加入到15mL离心管后，将15mL离心管置于低速离心机中配比平衡后，1000 rpm/min离心3 min；

        2.5 重悬：离心后弃上清，加入1 mL Serum-Free干细胞冻存液（AC-1001011/AC- 1001012）对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3~5次后，将其加入到1.8mL冻存管中；

        注意：冻存液即用即拿，及时放回4℃冰箱。通常生长状态相同且同时消化的细胞统称为一批细胞。

        2.6 记录：在冻存管上标记冻存细胞种类、时间、操作者及细胞批次。

        2.7 -80℃冰箱平衡：冻存管置于-80℃冰箱过夜。

        注意：冻存管放置于-80℃冰箱时，要将冻存管直立放置，切忌冻存管斜放或横放。

        2.8 液氮冻存：冻存管置于 -80℃冰箱过夜后，第2天将其置于液氮中进行长期保存。