用人工气候箱进行植物组织培养外植体的接种与培养

一、外植体的接种

外植体的接种是指把经过表面消毒处理的材料切割后转接到培养基上的过程。此过程是在无菌条件下进行的主要包括：修剪切割和接种两个过程。

（一）、修剪切割

1、茎段切割，一般来讲茎段切割是将消毒完毕且经过无菌水冲洗的茎段外植体切割成1-2cm的小段（带1-2个腋芽），同时将接触过消毒剂部分的切口切除一定的组织，使其露出新鲜的没有经过消毒剂接触的切面。

2、鳞茎类的切割，一般来讲是将新鲜鳞茎片或者鳞茎盘切割成合适的小块，然后接种在培养基上。如百合是将外层剥开，取出新鲜的鳞片，然后再无菌的条件下切割成1.0-2.0cm2的长方形小块。一般来讲下部的组织比上部的成功几率要大。大蒜是使用鳞茎盘进行培养，先将鳞茎盘切下，然后将鳞茎盘切成0.5*0.5cm2的小块。

3、叶片类切割，叶片类一般是将其切割成0.5-1cm2的小块（可用手术刀切割也可使用打孔器切割），背面朝下接种在培养基上（视品种而定，有些品种正面比背面的效果好）。

4、茎尖类切割，此过程是借助体视显微镜来完成的。在显微镜下将外层的组织逐层剥离，当一个透亮的半圆球（不同植物，样子有差异）的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带1-2枚叶原基，然后将其接到培养基上。注意：剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。

（二）、接种

1、平铺于培养基表面，此方法一般适用于种子、叶片、鳞茎组织等外植体材料。

2、插入培养基，此方法主要针对茎段类外植体，插入培养基时应该注意材料的极性，一定要将极性上的下端插入培养基，切勿弄反！

二、外植体的培养

在接种之后，将外植体放在人工气候培养箱内进行培养。一般来说，对外植体生长发育有影响的主要包括温度、湿度、光照和PH值等培养条件。

（一）、温度

在植物组织培养中，不同植物繁殖的MAX适温度不同（百合约为20℃、月季25-27℃、番茄28摄氏度……），在25±2℃的条件下大多植物组织都可以正常生长。低于15℃时，培养的外植体组织生长出现停滞，但高于35℃对生长也不利。促进芽发生的温度可略低，如烟草芽形成以18℃MAX合适，12℃以下或33℃以上出芽率均低。有时候高温处理既可获得无病毒苗，又影响到器官发生。如草莓的茎尖分生组织经38℃处理3-5天，提高了无病毒茎尖分生组织的成活率。在一些木本植物，如桃的胚培养中，一定时间的2-5℃低温处理有利于提高胚的成活率。

（二）、光照

光是组培中的重要环境条件，它对外植体生长和分化有很大的影响，表现在光照、光质和光周期等方面。

有的材料适合光培养，有的则适合暗培养，如玉簪花芽和花茎的培养，前者愈伤组织的诱导，以暗培养比光培养下的高，而后者则只有暗培养才能诱导出愈伤组织。

光质也影响着外植体愈伤组织的诱导、组织的增殖及其器官分化。如对杨树愈伤组织的生长，红光有促进作用，蓝光则有阻碍作用。在百合珠芽增殖和分化时发现，在红光下8周后不仅产生愈伤组织，同时可以直接分化出苗，11周后所产生的愈伤组织也分化出苗；而在蓝光下12周后才出现愈伤组织；白光下则未见愈伤组织的形成，可见红光能促进生长和分化。与白光和黑暗条件相比，蓝光明显促进绿豆下胚轴愈伤组织的形成。在用白、红、绿、蓝等不同光质培养双色花叶芋时，发现不同光质不仅能影响培养物的生物总量，还能影响器官发生，其中以黄光诱导发生的频率MAX高。关于光质对不同种类材料的试管苗增殖和分化的影响不一致，可能与植物组织中的光敏色素和隐花色素有关。

关于光周期对试管苗外植体的增殖和分化，通常都选用一定的光周期来进行外植体的组织培养，如光周期为16h光照、8h黑暗。有人发现非洲菊的增殖随光照时间的延长而加快，但超过16h又无作用。在石刁柏的茎尖培养中，根和茎的分化需要每天16h1000Lux照度的光照；而菊芋块茎培养中，每天12h光照就有利于根的形成。对短日照敏感的葡萄品种，其茎切段的组织培养物只有在短日照条件下才能形成根；反之，对日照长度不敏感的品种则在任何光周期下都能生根。

（三）、培养基的pH值

外植体的培养增殖都要求一定的pH值。通常一般培养基的pH值都在5.6-6.0之间。如果pH值不适则直接影响外植体的营养物质的吸收，进而影响外植体的脱分化、增殖和器官形成。不过pH值对不同植物的影响会有差异，如兰花宜偏酸些，pH值5.2或更小些。而玉米胚乳愈伤组织在pH值7.0时鲜重增加MAX快，在pH值6.1时干重增长MAX快。

（四）、湿度

组织培养中的湿度影响主要有两方面：一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100％；二是培养箱的湿度，控制条件差的实验室的湿度变化随季节而有很大变动，往往是冬天因室内温度比室外高，结果室内湿度低；而夏天却因室内温度比室外低，结果室内湿度高。湿度过高过低都不利于培养物生长。室内湿度过低会造成培养基失水而干枯或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；而过高又会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，我们要求组培室内建议是加装湿度控制系统人工气候培养箱内常年保持70％左右的相对湿度。