几种简易的菌种保存方法

        菌种作为一项重要的生物资源，对微生物学教学和研究是*的。菌种保存方法因微生物的不同而异。在菌种保存过程中，必须使微生物的代谢处于MAX不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，故菌种保存方法多依据这三个因素而设计。

        菌种保存方法有多种，较合适的为真空冷冻干燥法，具有保存时间长、成活率高、变异小等优点，但操作技术难度大，花费高，需特殊设备，一般单位不易做到，而一些常规方法，常因传代次数多、易污染、易变异，给保存带来诸多不利。

        一、需要4℃冰箱保存

        1、液体石蜡保存法

        先将液体石蜡灭菌，然后放于37℃恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将需要保存的菌种在MAX适宜的斜面培养基中培养，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，用量以高出斜面顶端1cm为准。试管需直立，置4℃或室温下保存，一般无芽胞细菌可保存1年左右。

        2、高层半固体琼脂石蜡保存法

        将需保存的菌种经平板划线分离后，挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高层半固体琼脂培养基中，经37℃12小时培养后取出，用无菌操作将灭菌的液体石蜡滴加半固体琼脂菌种管表层约0.5cm高度，存放4℃冰箱，1年转种1次。

        3、蒸馏水保存法

        取灭菌蒸馏水6-7ml加于试管斜面上，用吸管研磨，洗下菌苔充分混匀，将此菌液分装于灭菌的螺旋小瓶中，或用胶塞密封，置4℃保存可存活数年。

        二、需-20℃冰箱冷冻保存

        1、甘油保存法

        甘油一生理盐水保存液的制备：取甘油(分析纯)8份加入生理盐水2份，充分混合后，经121.3℃30分钟灭菌备用。

        将纯化后的菌株根据菌种不同分别划线接种于其MAX适宜生长的培养基上培养后，用接种针取典型菌落接种肉汤管37℃培养6-8小时(链球菌和奈瑟氏菌接种血清肉汤管，5-10%CO2环境下8-10小时培养，真菌直接用接种环取菌洗入肉汤管，不培养)。此为培养液。

        将此培养液与保存液以5：2的比例混合分装于灭菌的微量离心管，置-20℃冰箱保存(链球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用时需37℃水浴中快速解冻。

        用上述方法保存一般菌株可存活3年以上，链球菌、奈瑟菌可存活12-15个月，且性状未发生变异。此方法采用幼龄肉汤培养物效果好，且适用于链球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种。

        2、低温保存法

        菌种保存液的配制：K2HPO412.6g，柠檬酸钠0.98g，MgSO4·7H2O0.18g，KH2PO43.6g，甘油88g加蒸馏水至1000ml，103.4KPa灭菌30分钟，4℃保存备用。

        将细菌接种于肉汤培养基中，37℃培养16-18小时，或斜面培养物刮取于生理盐水中，然后加入等体积的菌种保存液，冻存于-70℃或-20℃冰箱中。

        此方法也适合甲链、肺球、流感杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌等耐受力低的细菌。-70℃保存10年以上，-20℃可保存2年以上。

        3、细菌湿种牛奶冻存法

        新鲜牛奶或15%奶粉煮沸，冷却脱脂，分装小试管，每管1ml，8磅15分钟灭菌备用。

        将纯种菌接种于平板，37℃16小时培养，以接种环刮取菌苔2-3环于牛奶中混匀，试管用硅胶塞，冻存于普通冰箱冷冻室(-12℃-18℃)。使用时取出室温溶解，待部分溶解时即可取一环接种平板，并将试管再迅速冻存，这样可反复使用3-5次。此法一般菌株可存活48个月，少数如奈瑟氏菌、甲链、白喉等可存活14-30个月。

        4、甘油原液保存法

        将各待保存的菌种纯化后用接种环直接从平板上刮取，置于盛有0.5ml甘油原液的菌种瓶中，低温保存箱-20℃保存，可连续52个月存活良好。

        此法尤其适合乙链、破伤风杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌种，是一种简便实用的有效保存方法。

        三、需低温-30或-70℃冰箱保存

        全羊血冷冻菌种保存法

        1、脱纤维羊血

        无菌抽取羊颈静脉血后，沿瓶壁注入无菌的带玻璃的三角烧瓶中，同时立即同一方向振摇约8-10分钟，脱去纤维，然后分装加盖无菌小试管中约1.0-1.5ml。

        将脑膜炎双球菌、淋球菌、甲乙型链球菌、肺炎双球菌分别接种于血平板培养基中，前两者置于5-10%CO2烛缸内，经35℃16-18小时培养，后三者置37℃恒温箱培养24小时，然后无菌操作取一接种环菌苔移种于上述新鲜脱纤维羊血试管中，立即置-3O℃冰冻保存二年转种一次。用时室温自然冰融即可接种。

        2、纸片法

        新华定性滤纸剪成4mm×4mm，1.5ml带盖离心管消毒灭菌备用，用消毒小钳子钳上滤纸片于平板上刮取待保种的纯菌落2-3个。放于离心管内塞盖再用封口胶布将盖边缘封好放于-30℃冰箱保存。保存12个月后取出菌种解冻后用无菌钳取一片放于肉汤管内37℃培养12小时后转种血平板，性状未变异。

        3、奶粉液菌种保存法

        菌种保存液：脱脂奶粉10g，NaCL10.5g，加双蒸水100ml，121℃5分钟高压灭菌后分装于1ml带盖无菌标本杯中(0.5ml)备用。

        无菌操作用4mm×10mm无菌滤纸条蘸取新鲜菌少许，放存含奶粉液保存杯中，盖好，封口胶封口，低温保存。3年存活率达99.2%。

        使用时将标本杯取出，不等全部融化，上层有少许融化即用接种环取一少许接种于血平板分离即可。

        四、结论

        菌种是细菌工作中所*而又具有传染性生物学因子。为了保证工作和安全，对菌种必须妥善保存和保管。保存菌种不仅要求不死，还要求其生物学性状、生理特性、抗原性等方面不发生变异，这是保存菌种的重要环节。延长菌种存活期应注意：首先，待保存菌种须选择生长期幼龄培养物，且制成浓菌液保存，以保证存活率。其次，高层半固体培基建议选择不含或含糖量低的培基，可减少或避免因代谢产物产生而造成的细菌死亡。MAX后，保存温度的高低可影响存活率，切忌反复冻融。