培养基促生长实验

          培养基促生长实验操作

         1  目的 

         制订培养基灵敏度实验操作，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。 

         2  范围 

         适用于所有配制好并灭菌的培养基。

         3  编写依据 

         EP6.5

         4  术语 

         无 

         5  职责 

         QC卫检组人员负责培养基的配制、灭菌、灵敏度实验。 

         6  内容 

         6.1  使用的设备、器具 

         生物安全柜、无菌培养皿、无菌刻度吸管或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、酒精灯等 

         6.2  使用的菌株 

   EP检测用ATCC的菌株:

    金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus        ATCC 6538

    大肠埃希菌Escherichia coli                 ATCC 8739

    铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa     ATCC 9027       

    枯草芽孢杆菌 Bacilllus subtilis         ATCC 6633

    沙门氏菌Salmonella enterica subsp      ATCC 14028

    白色念珠菌Candida albicans             ATCC 10231

    黑曲霉Aspergillus niger                     ATCC 16404

         培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代, 并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。

         6.3  检测频率 

         每批配制、灭菌后的培养基均应做灵敏度测试。 

         6.4  操作方法

         6.4.1  对照标准培养基

         用已经过实验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基.

         6.4.2  实验培养基

         将琼脂类的实验培养基在鼓风干燥箱内加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20ml，备用。液体类的培养基直接使用。

         6.4.3  菌悬液的制备

         6.4.3.1  细菌菌悬液的制备

         方法一：取细菌的斜面培养物1耳匙接种在酪蛋白大豆消化肉汤培养基中30～35℃电热恒温培养箱培养18～24h，取上述培养物用无菌水按10倍系列稀释，分别制成10-7～10-8的菌悬液备用。 

         6.4.3.2  霉菌菌悬液的制备

         取白色念珠菌的斜面培养物1耳匙接种在沙氏琼脂斜面上于20～25℃培养24～48h，加入无菌水4ml制成原液，取上述原液按10倍系列稀释，分别制成10-6～10-7的菌悬液备用。 

         取黑曲霉的斜面培养物加入无菌水4ml制成孢子悬液，取上述孢子悬液按10倍系列稀释，分别制成10-6～10-7的菌悬液备用。 

         方法二：直接用杭州微球生物技术有限公司的产品-培养基灵敏度指示剂，该产品已经帮我们控制了细菌数量，只要直接拿稀释液稀释下就可以直接取到10～100CFU试验菌。使用方便，数量。推荐用此方法操作。

         6.4.4 培养基的生长促进实验 

         6.4.4.1  琼脂类培养基的生长促进实验   

         每株菌用2个实验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种0.1～0.5ml的菌悬液（约10～100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养,取出平皿点计菌落数。实验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的70%-150%范围内。

         6.4.4.2  液体类培养基的生长促进实验 

         每株菌用2管（或瓶）实验培养基，接种0.1～0.5ml的菌悬液（约10～100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养,对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。 

         6.4.5  培养基的生长促进和抑制特性试验 

         6.4.5.1  液体培养基的生长促进特性试验 

         接种0.1～0.5ml的菌悬液（约10～100CFU试验菌）于一定量适合的培养基。在特定温度下培养，培养时间不超过试验中规定的MAX短期限。与对照标准的培养基获得的微生物生长相比，接种微生物的生长应明显。

         6.4.5.2  固体培养基的生长促进特性试验 

         采用表面涂布法，在每一块平皿上接种0.1～0.5ml的菌悬液（约10～100CFU试验菌）适宜微生物。在特定温度下培养，培养时间不长于试验中规定的MAX短期限。接种微生物的生长与对照标准的培养基获得的微生物生长相当。 

         6.4.5.3  液体或固体培养基的抑制特性试验 

         用适当培养基接种至少100 CFU适宜微生物。在特定温度下培养，培养时间至少为试验中规定的MAX长期限。无受试微生物生长。