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试剂盒因子法体外培养NK细胞
发布时间:2021-07-05   点击次数:163次

NK细胞主要分布于外周血,占外周血淋巴细胞总数的5-10%,无需抗原提呈细胞作为中介提呈抗原,也无需抗体帮助,可直接清除衰老细胞、变性细胞、癌细胞及病毒感染细胞等。

NK细胞属于白细胞的一种,它是人体忠诚的卫士,主要任务就是消灭那些已经被病毒感染的细胞,从而把病毒消灭在“摇篮”中。另外,身体里面的肿瘤细胞也是它们追杀的对象。

NK细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起到非常重要的作用,是一种有效、安全的肿瘤生物免疫治疗方法,具有广阔的应用前景。

分离培养NK细胞有多种方法,以下是采用某种试剂盒的因子法体外培养方法来培养NK细胞:

这种方法采用自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞,经体外操作使NK细胞扩增活化,通过激活体 内特异性免疫反应达到杀火肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗方法。

1.NK细胞培养试剂盒包含:

①无血清培养基2瓶(l000mL/瓶):

②NK试剂A, 1支:

③NK试剂B, 1支:

④NK试剂C, 1支:

⑤NK试剂D, 1支:

⑥NK试剂E, 1支:

培养体系中需用到2支(100万IU/支)rH IL-2

2.原材料

1.采取外周血(可从脐血、骨髓等组织)

2.需的试剂耗材包括:

0.4%苔盼蓝溶液、生理盐水、人淋巴细胞分离液(建议选用GE)、175cm²培养瓶、GT-T610 (A)培养袋、15ral/50ml/250ml离心管、移液管、1毫升无菌注射器

3.NK细胞培养时间过程:

前一天:要提前处理好细胞活化瓶(NK试剂A)

第1天:进行外周血单个核细胞分离与诱导(NK试剂B)

第3天:NK细胞第一次补液,补液50ml(NK试剂C)

第5天:NK细胞第二次补液,补液175ml (NK试剂D)

第7天:NK细胞第三次补液,装袋并补液500ml (NK试剂E)

第9-10天:NK细胞第四次补液,分袋并补液750ml

第12天:NK细胞第五次补液.补液500ml

第13天:检菌

第14、15天:培养成功

(细胞培养成功时间视具体细胞生长情况而定,在保持培培养基ph和细胞活力正常的情况下也可以多培养一天)

4.具体操作步骤如下:

头一天一定要先处理细胞活化瓶。

2.将NK试剂A (4度保存)加入到含有12.5ml生理盐水的175cm²底面积细胞培养瓶中,充分的混匀 30秒-1分钟,使液体充分在瓶底分散,4度冰箱平放过夜

(NK试剂A需要和生理盐水充分混匀平铺在瓶底;次日取出后直接吸弃液体即可,无需清洗)

3.外周血单个核细胞分离与诱导(第1天)

4.以100ml外周血为例,如血量不同,也可按操作规程做相应调整。

5.将患者外周血,用移液讶吸取少许原血(约300 ul)划线或滴入平皿过行检菌。然后,正常室温下,进行离心。

6.将上层血浆转入离心,灭活,离心,取上清液备用。

7.使用等体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀后,小心加到Ficoll层上,使分层保持清晰。室温内进行离心。

8.吸取外周血单个核细胞(PBMC)层,尽量吸尽两液面交接处的细胞层.加生理盐水吹打混匀,离 心。相同方法冉次洗涤细胞。

9.弃去上清后,用无血清培养基重悬细胞,吸取少量细胞计数。

10.按照细胞密度为1-2*10^6个/ml(最优为5 *10^6个/ml),用培养基清洗离心管,并入培养瓶内,并加入1支NK试剂B,患者灭活血浆1.25ml (5%)确保培养基终体积为25ml左右。剩余血浆4°C 密封保存备用。

注:包被瓶取出时间为细胞加入前5分钟,其他时间需在4度放置备用。

试剂A、B、C、D、E的取用.違议第一次吸取原液后.以适貴培养基冲洗西林瓶后再吸出,减少损耗

11.活化培养基的配置:其中1瓶无血清培养基中,加入100万IU的IL-2,终浓度为1000IU/mL。

注:活化培养基每次使用前恢复至室温。

12.NK细胞的第一补液(第3天),补加含有5%的患者灭活血浆和NK试剂C,确保培养的终体积为 75mL。

13.NK细胞的第二次补液(第5天),补加含有5%的患者灭活血浆和NK试剂D,确保培养的终体积为 250ml。

14.NK细胞的第三次补液及其装袋(第7天),细胞转袋前将培养瓶底部的细胞进行轻微吹散细胞,随后将培养瓶的中的细胞悬液及其500mL活化培养基,装入到细胞培养袋中,同时加入1支NK试剂E,及其剩余的全部血浆,确保终体积为750ml。

15.NK细胞的第四次补液(第9天),主要为分袋操作,将培养体系由750ml扩增至1500ml。

16.NK细胞的第五次补液(第!2天).主要为补液操作,将剩余的500mL扩增液均分到2个培养袋中,确保每袋体积为1000ml。

17.检菌,细胞培养第13天,对细胞悬液进行检菌、内毒素检测。用5ml注射器分别从培养瓶和袋内抽取少最细胞悬液,加入正置的平皿中,放入恒温培养箱, 记录放入日期及培养物品。隔夜后倒置,保留48小时。

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