仔猪生精细胞体外培养、增殖及分化研究

本实验通过比较两种生精细胞(spermatogenenic cell)的培养方法，观察生精细胞体外培养过程中的生长行为，并检测增殖分化情况，以建立发生体外培养系统，为进一步研究发生机理奠定基础，并为治疗雄性不孕、阐明环境污染物对雄性生殖的损害提供基础数据，还能为制备转基因动物、挽救濒危野生动物提供新的思路。

 采用生精细胞混合培养和组织块培养进行仔猪睾丸生精细胞体外培养，分别从生精细胞在体外培养过程存活率、存活时间及分化程度等方面进行比较。结果显示生精细胞混合培养过程中，检测第1d)存活率为(91.66±0.46)％，第2d存活率达到(95.41±1.11)％，第3d存活率降低为(94.15±0.32)％；组织块培养中生精细胞存活率一直较高且稳定，检测第1d存活率为(96±0.58)％，随着培养时间延长，存活率逐步上升，第2d、3d存活率均为98％，与混合培养存活率相比，存活率差异极显著(F=62.15，P＜0.001：q=3.59，P＜0.001)；生精细胞混合培养5d后，生精细胞分化的最高程度为次级精母细胞，组织块培养9d后生精细胞分化的最高程度为四分体细胞。

 为了进一步了解睾丸组织块培养体系中生精细胞增殖及分化情况。本实验采取以下培养条件：DMEM／F12基础培养基，每毫升培养液中含有100IU青链霉素、Vc(10~(-4)M)、VE(10μg／ml)、FSH(10~(-4)mg／ml)、胰岛素—转铁蛋白(10μg／ml)，34℃，5％CO2，95％空气气套式二氧化碳培养箱中静置培养，对仔猪睾丸组织块进行了2～4周体外培养。

通过溴脱氧核苷尿嘧啶(5′-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU)体外标记S期生精细胞DNA，细胞免疫荧光技术检测生精细胞体外增殖情况；采用HE染色及透射电子显微镜技术从普通生态学及超微结构两个方面检测体外培养前后生精细胞分化程度。结果显示：(1)Brdu标记检测发现，在经过15d，20d体外培养后生精细胞增殖明显，体外培养15d可见大部分生精细胞以集落形式存在，呈念珠状或哑铃状，少数细胞以单细胞形式存在，集落包含有2-cell、4-cell、6-cell等偶数生精细胞集落，也包含奇数细胞个数的细胞集落，如3-cell、5-cell、9-cell等，主要为小于10-cell细胞集落。

体外培养20d，荧光显微镜图显示，仍可见许多细胞集落，集落多为2-cell及单个的生精细胞。(2)HE染色结果显示，体外培养15d，精原细胞通过间桥连接附着于支持细胞上，支持细胞核不规则，以2个核仁常见，偶见正在分裂的次级精母细胞，未见细胞；体外培养第20d，可见多个正在分裂的次级精母细胞，还观察到Sb、Sc型细胞，Sb型细胞胞核为圆形，胞核为蓝紫色，胞核略微偏向一极；Sc型细胞胞核卵圆形，蓝紫色，核偏极程度比Sc严重，染色质较Sb致密。(3)透射电子显微镜结果表明支持细胞胞质不如培养前丰富，线粒体明显减少、轻度肿胀，内质网无明显变化。

体外培养后观察到了2个典型细胞，胞核呈“苹果"状，在细胞核顶端有高电子密度顶体囊泡形成，胞核一侧可见高尔基体、线粒体和内质网，线粒体由培养前的形态正常、丰富变为培养后的轻度、高度肿胀，且较培养前数量减少。 结论：(1)本实验条件下组织块培养生精细胞体外存活率更高，生精细胞分化程度较高：(2)睾丸组织块培养的生精细胞能够在体外较好增殖，通过细胞间桥连接小于10个生精细胞集落，生精细胞集落包含偶数、奇数个细胞；(3)HE染色普通形态学及透射电子显微镜超微结构均显示生精细胞能够在体外分化为细胞。