组织培养技术是在人为创造的无菌条件下将生物的离体器官（如根、茎、叶、茎段、原生质体）、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。

       体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背 景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施 亦不尽相同，现介绍主要组织细胞培养的要点如下：

       上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜， 因此培养在有胶原的底物上可能利于生长， 另外人或小鼠表皮细胞培养在以 3T3 细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低 PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，

       内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。       研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法尤为简便，其法如下：

       1、产后新鲜脐带，无菌剪取 10—15 厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于 4℃。

       2、用三通注射器吸取温 PBS 液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧， 以防液体返流。

       3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入浓度为 0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化 3—10 分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。

       4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS 轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复） 。

       5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

       神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象， 但很难使之增殖。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用 ROUS病毒和SV4等诱发转化。

       一．设备：无菌操作设备。

       二．大型设备

CO2培养箱：恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。        

倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜：用于准确地取材。

常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。

电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。

过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。

渗透压仪：pH剂，天平等。

       三．培养器皿及手术器械

1.培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。

2.培养板：24-40孔，可用于开放培养。

3.培养瓶；

4.吸管：常用1，5，10mL，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5.各类培养液贮存器。

6.小型手术器械。

       准备

       一.配制培养液

（1）解剖液：以无机盐（去除Ca2+, Mg2+ ）加葡萄糖配制成PBS缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。

（2）基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。

（3）接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。

（4）维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。

       二.培养基质

常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶。

       三.消毒培养皿的备用

所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前1天进行。

       神经细胞分散培养

       （一）选材

       常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。

       （二）取材

       脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。

       （三）细胞分离与接种

       神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×106），做电生理应为5×105或更低。

       （四）抑制胶质细胞生长

培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长