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组织培养技术

更新时间:2022-03-17  |  点击率:1121

       组织培养技术是在人为创造的无菌条件下将生物的离体器官(如根、茎、叶、茎段、原生质体)、组织或细胞置于培养基内,并放在适宜的环境中,进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。

       体内组织细胞在体外培养时,所需培养环境基本相似,但由于物种、个体遗传背 景及所处发育阶段等的不同,各自要求条件有一定差别,所采取的培养技术措施 亦不尽相同,现介绍主要组织细胞培养的要点如下:

       上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮组织,故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞,培养时生长速度往往超过上皮细胞,并难以纯化,同时上皮细胞难以在体外长期生存,因此纯化和延长生存时间是培养关键。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜, 因此培养在有胶原的底物上可能利于生长, 另外人或小鼠表皮细胞培养在以 3T3 细胞为饲养层(用射线照射后)时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低 PH、Ca2+含量和温度,向培养基中加入表皮生长因子,均有利于表皮细胞生长。以表皮细胞为例,用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞,

       内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞,对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子(TAF)等有很大价值。       研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法尤为简便,其法如下:

       1、产后新鲜脐带,无菌剪取 10—15 厘米长一段,如不能立即培养,可于12小时内保存于 4℃。

       2、用三通注射器吸取温 PBS 液注入脐静脉中洗去残血,在入口处用线绳扎紧, 以防液体返流。

       3、用血管钳夹紧脐带一端,从另一端向脐静脉中徐徐注入浓度为 0.1%的粗制胶原酶,充满血管,消化 3—10 分钟;注入口用线绳扎,以防液体返流。

       4、吸出含有内皮细胞的消化液,于离心管中,注入温PBS 轻轻反复冲洗后,一并注入离心管中(此步骤可重复) 。

       5、离心去上清,加入RPMI1640培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

       神经细胞(神经元)不易培养,只有在适宜情况下,如接种在胶原底层上,或加入神经生长因子和胶质细胞因子时,可出现一定程度的分化,长出突起等现象, 但很难使之增殖。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养,不仅能获得生长的胶质细胞,也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来,胶质细胞在培养中生长不稳定,不易自发转化,但对外界因素仍保持很好的敏感性,可用 ROUS病毒和SV4等诱发转化。

       一.设备:无菌操作设备。

       二.大型设备

CO2培养箱:恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。        

倒置显微镜:用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜:用于准确地取材。

常温冰箱:-4℃,用于保存各种培养液,解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱:-20℃--80℃,用于储存血清酶,贵重物品和试剂。

电热干烤箱:用于消毒玻璃器皿。高压消毒锅:用于消毒培养皿,手术器械。

过滤器:配制解剖液、培养液,必须过滤后才可使用,以去除细菌。

渗透压仪:pH剂,天平等。

       三.培养器皿及手术器械

1.培养皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直径。

2.培养板:24-40孔,可用于开放培养。

3.培养瓶;

4.吸管:常用1,5,10mL,均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5.各类培养液贮存器。

6.小型手术器械。

       准备

       一.配制培养液

(1)解剖液:以无机盐(去除Ca2+, Mg2+ )加葡萄糖配制成PBS缓冲液,保持一定的渗透压和pH值。

(2)基础培养基(MEM):主要为多种氨基酸,加入葡萄糖,双蒸馏水溶解。

(3)接种培养液:用于胰酶消化后的细胞分散,做成细胞悬液,其成分为MEM含1%谷氨酰胺,另加入10%马血清,当天配制。

(4)维持培养液:接种后24h,全部换成此液,后每2周换一次,每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清,1%谷氨酰胺,及适量的支持性营养物质。

       二.培养基质

常用鼠尾胶、小牛皮胶,多聚赖氨酸,再涂胶。

       三.消毒培养皿的备用

所有培养器皿均需清水冲洗2-3d,达两次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包装,置于烤箱中干燥消毒,于培养前1天进行。

       神经细胞分散培养

       (一)选材

       常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜,小鼠以18d为宜,大鼠纹状体以10d为宜;若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚,则黑质以13d,纹状体18-21d为宜;小脑以20-21d小鼠胚胎,所获蒲氏细胞成活率高,颗粒细胞正在分化;脊髓与DRG联合培养,常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神经成活率高。

       (二)取材

       脑则取出相应组织,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上,用小刀将其要成背腹两侧,分别培养。

       (三)细胞分离与接种

       神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接种液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用细口吸管吹打细胞悬液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上层细胞悬液,计数,预置细胞密度,接种于培养皿(1×106),做电生理应为5×105或更低。

       (四)抑制胶质细胞生长

培养3-5d后,也有人认为培养7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神经胶质细胞的生长

 

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