细胞实验室最常面对的难题就是:如何保持无菌。细胞一旦遭到污染,所有的实验结果都会变得毫无意义。
细胞污染的主要原因包括:操作技术不严格、试剂质量不达标、大气中孢子计数增加、二氧化碳培养箱或操作台使用和维护不当等。
因此,在细胞培养过程中,操作者不仅要严格遵守标准的操作程序,同时还要特别注意新产品、新品牌、以及设备的清洁维护。同时,及时检测并鉴定细胞是否被污染同样至关重要。
预防措施:
在细胞培养过程中,潜在的污染途径主要包括操作技术和环境,其中环境因素又包括了无菌试剂和材料、超净工作台、恒温恒湿培养箱、水浴锅和冰箱等。
一、操作技术
培养操作前:
⑴ 个人卫生:进入细胞培养室时应更换实验室专用鞋或者穿鞋套;穿戴实验服、口罩和手套,用消毒酒精(75%浓度的乙醇)擦拭双手;如果操作者是长发,应扎于脑后。
⑵ 工作台准备:提前 0.5~1h 打开超净台的紫外灯进行消毒;用蘸有消毒酒精的纸巾擦拭超净台的台面、挡板等。
⑶ 试剂准备:从冷藏室或冷冻室取出所需的培养基等试剂
须注意的事项有:外套、背包等物品,易附着丰富的微生物,不应带入细胞房。
培养操作中:
⑴ 台面布置:按实验需要和个人习惯,合理放置试剂、耗材、仪器等物品;点燃酒精灯后开始实验操作。
⑵ 操作:靠近火焰进行实验操作;试剂瓶
须注意的事项有:操作要准确、敏捷、有序;吸取溶液时,应专管专用,避免交叉污染;吸管管口要向下倾斜,以防止液体倒流进入移液器内发生污染;尽量减少细胞和培养基的敞口时间;已开口的试剂瓶尽可能的倾斜放置,防止下落微生物的污染;避免在敞口的细胞培养皿
培养操作后:
⑴ 整理:将试剂放回原来的存储位置;整理工作台面,物归原位,合理丢弃废液和废物。
⑵ 消毒:用消毒酒精擦拭台面;打开超净工作台和细胞房的紫外灯,照射至少15 min。
须注意的事项有:紫外灯开启后,人不能进入,紫外线对眼睛和裸露的皮肤均有危害,若要进入,一定要先关闭紫外灯,待人离开后打开。
二、环境
如果操作者技术规范且操作严谨,那么当环境恶化时,也会导致污染风险的增加。进行细胞培养时,环境必须洁净。
细胞污染一个主要的途径就是二氧化碳培养箱。二氧化碳培养箱在培养细胞取出和放入的过程中,直接与空气接触,微生物会被夹带进入;加之其内部湿度高、温度适宜,特别有利于真菌繁殖。细胞培养瓶或培养皿,如果接触了操作台以外的地方,在放入培养箱前须经消毒酒精擦拭。 但须注意的是,消毒酒精要经操作台吹干,否则会导致培养箱内乙醇浓度升高,酒精会影响细胞的正常功能。
在很多情况下, 细胞培养必须使用二氧化碳培养箱。为了有效的控制该污染途径,可采取的措施有:
①在加湿托盘内添加真菌抑制剂,如硫酸铜、十二烷基磺酸钠
②使用无毒抗真菌清洁剂对培养箱内外进行定期清洁,先用清洁剂、再用消毒酒精进行擦拭;为不留死角,清洁前应将培养箱内部能拆卸的部件都拆卸下来,清洁时也特别要注意不能拆卸的犄角旮旯处;
③不正确的使用空气过滤器,那将变为培养箱一个可怕的污染途径,故须按使用说明定期更换空气过滤器
④在使用过程中,任何溢出液必须立刻用消毒酒精清除干净;
⑤一旦发现培养物被污染,立马清走。