细胞培养的常见污染原因

       预防措施：

       在细胞培养过程中，潜在的污染途径主要包括操作技术和环境，其中环境因素又包括了无菌试剂和材料、超净工作台、恒温恒湿培养箱、水浴锅和冰箱等。

       一、操作技术

       培养操作前：

       ⑴ 个人卫生：进入细胞培养室时应更换实验室专用鞋或者穿鞋套；穿戴实验服、口罩和手套，用消毒酒精（75%浓度的乙醇）擦拭双手；如果操作者是长发，应扎于脑后。

       ⑵ 工作台准备：提前 0.5~1h 打开超净台的紫外灯进行消毒；用蘸有消毒酒精的纸巾擦拭超净台的台面、挡板等。

       ⑶ 试剂准备：从冷藏室或冷冻室取出所需的培养基等试剂，于37℃水浴锅中进行加热；加热后用消毒酒精擦拭瓶身，并立马放入超净工作台内。

       须注意的事项有：外套、背包等物品，易附着丰富的微生物，不应带入细胞房。

       培养操作中：

       ⑴ 台面布置：按实验需要和个人习惯，合理放置试剂、耗材、仪器等物品；点燃酒精灯后开始实验操作。

       ⑵ 操作：靠近火焰进行实验操作；试剂瓶经火焰旋转灼烧后打开；挑选吸管，快速的纵向在火焰上来回移动并做 180°旋转；将试剂瓶向吸管倾斜，吸出所需的液体量；灼烧瓶颈后，重新盖上盖子；等所有操作完毕后，拧紧瓶盖。

       须注意的事项有：操作要准确、敏捷、有序；吸取溶液时，应专管专用，避免交叉污染；吸管管口要向下倾斜，以防止液体倒流进入移液器内发生污染；尽量减少细胞和培养基的敞口时间；已开口的试剂瓶尽可能的倾斜放置，防止下落微生物的污染；避免在敞口的细胞培养皿及培养皿盖上方操作；不要面对工作台或二氧化碳培养箱讲话或咳嗽，防止口腔微生物随唾沫飞入而发生污染；若发生外溢，用蘸有消毒酒精的棉球及时擦去。

       培养操作后：

       ⑴ 整理：将试剂放回原来的存储位置；整理工作台面，物归原位，合理丢弃废液和废物。

       ⑵ 消毒：用消毒酒精擦拭台面；打开超净工作台和细胞房的紫外灯，照射至少15 min。

       须注意的事项有：紫外灯开启后，人不能进入，紫外线对眼睛和裸露的皮肤均有危害，若要进入，一定要先关闭紫外灯，待人离开后打开。

       二、环境

       如果操作者技术规范且操作严谨，那么当环境恶化时，也会导致污染风险的增加。进行细胞培养时，环境必须洁净。

       细胞污染一个主要的途径就是二氧化碳培养箱。二氧化碳培养箱在培养细胞取出和放入的过程中，直接与空气接触，微生物会被夹带进入；加之其内部湿度高、温度适宜，特别有利于真菌繁殖。细胞培养瓶或培养皿，如果接触了操作台以外的地方，在放入培养箱前须经消毒酒精擦拭。 但须注意的是，消毒酒精要经操作台吹干，否则会导致培养箱内乙醇浓度升高，酒精会影响细胞的正常功能。

       在很多情况下， 细胞培养必须使用二氧化碳培养箱。为了有效的控制该污染途径，可采取的措施有：

       ①在加湿托盘内添加真菌抑制剂，如硫酸铜、十二烷基磺酸钠，可抑制托盘内真菌的生长；亦或盛装无菌的去离子水，并每周进行更换，托盘用消毒酒精或高温灭菌的方法进行严格的清洁；

       ②使用无毒抗真菌清洁剂对培养箱内外进行定期清洁，先用清洁剂、再用消毒酒精进行擦拭；为不留死角，清洁前应将培养箱内部能拆卸的部件都拆卸下来，清洁时也特别要注意不能拆卸的犄角旮旯处；

       ③不正确的使用空气过滤器，那将变为培养箱一个可怕的污染途径，故须按使用说明定期更换空气过滤器；

       ④在使用过程中，任何溢出液必须立刻用消毒酒精清除干净；

       ⑤一旦发现培养物被污染，立马清走。