在实验室中,恒温培养摇床在蛋白质表达和纯化过程中扮演着重要角色,尤其是在微生物表达系统中。以下是使用恒温培养摇床进行蛋白质表达和纯化的步骤:
蛋白质表达
菌株选择与转化:
选择适合的宿主菌株(如大肠杆菌、酵母等)。
通过转化将含有目标基因的表达载体引入到宿主细胞中。
接种与预培养:
将转化后的细胞接种到含有适当抗生素的液体培养基中。
在恒温培养摇床上进行预培养,使细胞适应生长条件并达到对数生长期。
诱导表达:
向培养基中加入诱导剂(如IPTG、乳糖、醇等),以启动基因表达。
将培养容器放回摇床上,在适宜的温度下继续培养,通常在几个小时到过夜。
监控表达:
在诱导表达过程中,可以取样进行SDS-PAGE分析,以监控蛋白质的表达情况。
蛋白质纯化
细胞收集:
表达完成后,通过离心将细胞从培养基中分离出来。
细胞裂解:
使用物理或化学方法(如超声波破碎、高压匀浆等)裂解细胞,释放出蛋白质。
初步纯化:
根据蛋白质的性质,可能需要经过初步纯化步骤,如盐析、离心去除细胞碎片等。
亲和层析:
如果蛋白质带有融合标签(如His标签、GST标签等),可以使用亲和层析柱进行纯化。
将裂解液上样到预装好的亲和层析柱上,通过特定的缓冲液洗涤非特异性结合的蛋白质。
洗脱与收集:
使用洗脱缓冲液将目标蛋白质从亲和层析柱上洗脱下来。
收集洗脱液,并可能需要进一步的纯化步骤,如离子交换层析、凝胶过滤层析等。
纯度分析与鉴定:
使用SDS-PAGE、Western blotting、质谱等技术对纯化后的蛋白质进行分析和鉴定。
在整个过程中,恒温培养摇床确保了细胞在表达蛋白质时的生长条件稳定,这对于蛋白质的正确折叠和功能性至关重要。同时,通过摇动可以增加培养基中的溶氧量,有助于细胞生长和提高蛋白质的表达量。纯化步骤通常在室温或4°C进行,因此不涉及摇床的使用。