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怎样用恒温培养箱做提蛋白及蛋白定量的浓度实验?

更新时间:2017-09-06  |  点击率:2521

1、吸弃培养皿中的培养液。

2、往培养皿中加入2ml 冷的PBS轻轻荡洗2~3次,zui后一次,吸干培养皿中的PBS。

3、每个培养皿中加入70μl(以FLS细胞为例)裂解液。

裂解液的配置:

RIPA裂解液:蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物:RIPA裂解液(中)B液=100:1:1

(配置时实际配置的体积需比理论值高出几十微升)

4、将加入裂解液的培养皿轻轻摇晃,使裂解液与贴壁细胞充分接触,放入—70℃的冰箱,冷冻10分钟。

5、裂解完后,用干净的刮刀将细胞刮于培养皿的一处(动作要快,每个皿控制在3min),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。(整个操作尽量在冰上进行)

6、将离心管置于小型离心机上涡旋一下,然后置于4℃冰箱放置30min。(期间从冰箱拿出再进行涡旋一次)

7、将离心管放入高速离心机,于4度下12000rpm 离心5min。(提前开离心机预冷)

8、取出离心管,吸取上清液,上清液即蛋白液,对其进行定量,转移至新的1.5ml离心管。(定量需用的枪。)

9、对提取的上清液进行蛋白浓度的定量

蛋白定量的过程

①取干净的96孔板,进行区域选择板底扫描即读板(切勿用手触摸板底)

②首先在96孔板中加入18ul的PBS(做标准曲线的PBS)

③在18ul的PBS中加入2ul的样品

④zui后在加入200ul的BCA(加入后的BCA不进行与样品的混合,而是铺在样品的上面,用吹风机除去上方的气泡)

         BCA的配置: BCA试剂A:BCA试剂B=50:1

⑤放置37°恒温培养箱孵育30min

⑥读板(吸光光度值为562)

10、对剩余的样品按照体积5:1的比例加入Loading Buffer(6X)

11、将加好的样品放入离心机顺离,使离心管内壁的样品甩下。

12、将样品放入恒温金属浴锅中100℃煮7min

13、将煮好的蛋白放入—20℃冰箱中备用(在离心管壁上标记好样品名称、日期)

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