热门词:恒温培养箱马弗炉|网站首页|在线留言|联系我们

欢迎来到上海喆图科学仪器有限公司

上海喆图科学仪器有限公司

上海喆图科学仪器有限公司

产品分类展示

生化培养箱

霉菌培养箱

恒温恒湿培养箱

光照培养箱

人工气候箱

二氧化碳培养箱

多功能二氧化碳培养箱

电热恒温培养箱

隔水式恒温培养箱

鼓风干燥箱

立式鼓风干燥箱

高温鼓风干燥箱

真空干燥箱

数显真空度干燥箱

热空气消毒箱/干烤灭菌器

干燥培养两用箱

电热恒温水槽

电热恒温水浴锅

低温恒温槽

电热恒温加热板

一体式马弗炉

气浴恒温振荡器

恒温振荡器

低温培养箱

恒温恒湿箱(专业型)

厌氧培养箱

冷阱

精密鼓风干燥箱

远红外干燥箱

箱式电阻炉

陶瓷纤维马弗炉

药品稳定性试验箱

高低温(交变)试验箱

高低温(交变)湿热试验箱

培养摇床

数显石墨加热板

水浴恒温振荡器

恒温恒湿称重系统

熔喷布烘箱

联系我们

上海喆图科学仪器有限公司
上海喆图科学仪器有限公司

电话:021-80158181-103

传真:021-58582778-8002

QQ:123417331

E-MAIL:jiangjinhong@zhetu.cn

手机:17321198802

地址:上海市浦东新区瑞庆路528号18幢(张江高科现代医疗器械园)

您现在位置:首页 » 新闻中心
用电热恒温培养箱做大肠杆菌感受态细胞的制备实验
发布时间:2017-09-21   点击次数:1455次

细胞经过一些特殊方法(电击法、CaCl2法)等处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞,即感受态细胞(Compenent cells)。

实验方法原理:

带有外源DNA 的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大量复制、繁殖,才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化学试剂)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子通过。

实验材料:

E. coli DH5α菌株

试剂、试剂盒:LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB

仪器、耗材:培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管

实验步骤:

1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm),转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验,1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。

2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,培养物冷却至0℃。

3、于4℃用Sorvall GS3特头(或与之相当的转头)以4 100 r/min离心10 min,以回收细胞。

4、倒出培养液,将管倒置1 min以使zui后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。

6、于4℃用Sorvall GS3转头(或与之相当的转头)以41 00 r/min离心10 min,以回收细胞。

7、倒出培养液,将管倒置1  min以使zui后的痕量培养液流尽。

8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。

9、此时,可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验,也可以将细胞冻存于- 70℃。

注意事项:

1.  为达到转化,活细胞数务必少于108个细胞/mL,对于大多散大脑杆菌来说,这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高,可每隔15-20 min测定OD600值来监测,用监测的时间及OD值列一个图表,以便预测培养物的OD600值到0.4的时间,当OD600值达到0.35时,收获细菌培养物。

2.  在菌株与菌株之间,OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大,因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值,并将各稀释维度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞散,从而使分光光度计读数得到标准化。

3.  对大多数大肠杆菌(MC106除外),采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的结果。Dagert和Ehrlieh的实验(1979)曾表明,细胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h,在贮存的zui初12-24 h内,转化率增加4-6倍,然后降低到初始水平。

4.  克隆的新鲜程度,一定要选新鲜平板的单克隆,即刚涂布生长过夜的平板。

5.  菌体的OD600值,JM109或BL21,OD值为0.35,DH5α 为0.4,要尽量保证OD值不要过高,更不能超过0.6。

6.  低温处理的时间,做完后冰上保存12-24 h后分装,并保存于-80℃。

7.  试剂和用品,所有的用品(离心管、药瓶等)用新的,如果使用旧的,要确保干净,CaCl2溶液。

分享到:

返回列表 | 返回顶部
收缩
  • QQ咨询

  • 在线咨询
  • 点击这里给我发消息
  • 点击这里给我发消息
  • 点击这里给我发消息

化工仪器网

推荐收藏该企业网站