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菌种的培养
发布时间:2018-09-25   点击次数:746次

人们采取无菌操作的方法,把某种食用菌从混杂的微生物中,单独地分离开来,这个过程叫做菌种分离。从分离过程中得到的菌丝体纯化后,就是纯菌种。在实验室条件下,以人工使纯菌种大量生长和繁殖的方法,叫做培养。下面由小编带大家了解一下,如何培养菌种。

1.1材料

1.1.1 菌种 枯草芽孢杆菌。

1.1.2 培养基 (1)LB培养基:蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1000ml,pH为7,(可溶性淀粉20g)琼脂20g。

(2)筛选用培养基:含有2%可溶性淀粉的LB培养基。 

(3)种子培养基:豆饼粉4%,玉米粉3%,Na2HPO40.8%,(NH4)2SO40.4%,NH4Cl0.15%,H2O。

(4)发酵培养基:豆饼粉5.6%,玉米粉7.2%,Na2HPO40.8%,(NH4)2SO40.4%, NH4Cl0.13%,CaCl20.13%,α—淀粉酶50g。

【2】 1.1.3 主要试剂

蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、(Beef Extract)、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙。

1.1.4 仪器设备

控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计。

1.2方法

1.2.1 培养基的制备

(1)称量

按培养基配比依次准确地称取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入烧杯中,并在烧杯中加入少量蒸馏水。注:酵母膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯,也可放在称量纸上,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,酵母膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片。

(2)溶化

可溶性淀粉溶液的配制方法:将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中,加入少量蒸馏水,搅拌成糊状,然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸水中,一边搅拌一边加热,待其溶化成透明状后继续在电炉上加热5分即制成可溶性淀粉溶液。 如果配制固体培养基时,将已准备好的可溶性淀粉溶液倒入烧杯中,将称好的琼脂放入已溶的药品中,再加热溶化,补水到所需的总体积。在制备用三角瓶盛固体培养基时,一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中,然后按2%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中,不必加热溶化,而是灭菌和加热溶化同步进行,节省时间。 在琼脂溶化过程中,应控制火力,以免培养基因沸腾而溢出容器。同时,需不断搅拌,以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时,不能用铜或铁锅加热溶化,以免离子进入培养基中,影响细菌生长。  

(3)调pH 培养基配好以后,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH,直到pH达7为止;反之,用1mol/LHCl进行调节。 对于有些要求pH较精细的微生物,其pH的调节可用酸度计进行。 注意:pH不要调过头,以避免回调而影响培养基内各离子的浓度,配制pH低的琼脂培养基时,若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌,则琼脂因水解不能凝固,因此应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合,或在中性pH条件下灭菌,再调整pH。

(4)分装 按照实验要求,可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶中。 液体分装:分装的高度以试管高度的1/4左右为宜;分装三角瓶的量则根据需要而定,一般以不超过三角瓶的一半为宜。 固体分装:分装于试管中的应不超过试管的1/5,灭菌后制成斜面;分装三角瓶的量以不超过一半为宜。

(5)加塞 培养基分装完毕后,在试管口上塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好的通气性能。

(6)包扎 加塞后,将全部试管用麻绳捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,外边再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称,组别,配制日期。三角瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结扎好,使用时容易解开,同样注明。

(7)灭菌 将配置好且包扎完毕的固体、液体培养基及本实验涉及的试管、三角瓶等及400ml纯水于高压灭菌器中以0.14Mpa,121℃条件下高压蒸汽灭菌20分钟。

(8)斜面搁置 将培养基冷却至50℃左右时放置斜面,斜面在试管的1/2处为宜,待斜面凝固后,放置于冰箱中待用。

1.2.2菌种的筛选与保藏

(1)倒平板 将实验配制好的培养基加热溶化,待冷却至55—60℃时,倒平板9皿。

(2)稀释 用接种环取菌种,放入盛90ml无菌水的三角瓶中,振摇。用一支1ml无菌吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀,然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中,混合均匀,以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的菌液。

(3)划线  将平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5、10-6三种稀释度(共三组)然后用接种环分别沾取浓度为10-4、10-5、10-6稀释液并对号在相应平板上划线,室温下静止5—10min,使菌液吸附进培养基。

(4)培养 将培养基平板倒置于37℃的培养箱中,培养2—3天,观察淀粉圈。对有淀粉圈的菌落,测量淀粉圈的直径D,菌落直径r,计算D/r的比值,可进行拍照,选择淀粉圈较大的菌落作为后续实验的菌种。

(5)接种 接种到斜面培养基中,标注上日期等信息。放入恒温培养箱中培养作为一级种子。

(6)保藏 斜面置于37℃的培养箱中,培养2—3天,观察菌种长势好坏,若菌种长势好则将其放入冰箱中保藏,若长势不好则需多次斜面转接。

以上内容是由喆图小编整理的方案,希望能给您带来帮助;以上内容仅供参考,详情请咨询,上海喆图。

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