细胞分裂素对离体子叶的保绿效应实验

一、 目的

        使用恒温培养箱、恒温水浴锅、了解细胞分裂素对离体子叶的保绿作用及基本原理和方法。

二、原理  细胞分裂素可阻碍核酸水解酶和蛋白水解酶的产生，因此能延缓器官衰老，使离体叶片保绿，保绿作用的强弱可通过测定叶绿素含量的变化来衡量，也可由叶色变黄枯死的时间来衡量。  

三、材料、仪器设备及试剂  

1. 材料：黄瓜子叶；萝卜子叶。  

2.  仪器设备：电子分析天平；分光光度计；恒温培养箱；恒温水浴锅；25ml容量瓶；25ml刻度试管；试管架；移液管；黄瓜子叶的培养皿（直径5cm）；瓷盘；刀片；尖头镊子；滤纸；吸耳球等。  

3. 试剂及配制：100μg·ml－16－BA溶液；95﹪乙醇 ；CaCO3粉末。  100μg·ml－16－BA母液配制：准确称取6－BA 10mg,  加几滴1mol·L－1HC1溶解（可稍加热溶解），然后慢慢加入蒸馏水稀释后定容至100ml。  

四、实验步骤  

1. 黄瓜幼苗的培养  精选黄瓜种子，播入垫有滤纸的瓷盘中，加蒸馏水使之湿润（注意种子不能渍水），待种子萌发后，在光下培养2～3d左右，直至子叶绿化。备用。  

2. 系列浓度6－BA溶液配制：吸取100μg·ml－16－BA母液，稀释成10、5、0.5  μg·ml－1的系列浓度溶液。  

3. 离体黄瓜子叶的培养  

（1）取4套培养皿，编号，每套培养皿各垫一张滤纸，分别作0.5、5、10μg·ml－1的6－BA溶液和蒸馏水(CK)4个处理，即为组。  

（2）选取子叶大小、生长一致的黄瓜幼苗20株，每处理5  株（10片子叶），用刀片切下不附带叶柄的子叶，分别称取鲜重，将数据记入下表中。然后将子叶放入组相应编号的培养皿中，分别加入不同浓度的6－BA溶液3ml,  对照（CK）加蒸馏水3ml。盖上培养皿盖，置于暗处，温度25－28℃培养3 d 。  另取与组相同的黄瓜幼苗20株，用刀片切下不附带叶柄的子叶作第二组，直接用来测定叶绿素含量。  

4. 第二组黄瓜子叶叶绿素含量的测定  

（1）叶绿素的提取  取3支25ml刻度试管，编号。称取第二组的黄瓜子叶三份（3个重复），每份10片子叶，然后放入相应编号的刻度试管中，各加入少量CaCO3粉及95﹪乙醇3－4ml，用玻棒小心将子叶捣碎后，将试管放入45℃恒温水浴提取叶绿素30min左右，直到子叶碎片无色为止，用滤纸过滤于25ml容量瓶中（如残渣仍带绿色，可再加几ml乙醇继续提取，直至残渣无绿色）。滤纸上的色素用乙醇慢慢点滴清洗入容量瓶中，后定容至刻度，摇匀，待测。  

（2）叶绿素含量的测定  在652nm波长处，以95﹪乙  醇为空白对照，测定叶绿素提取液的吸光度（A值）。并按公式计算出叶绿素含量。即为培养前子叶的原始叶绿素含量。  

5. 组黄瓜子叶叶绿素残留量的测定  组黄瓜子叶在暗处培养3d后，按上述第（4）步骤方法分别测定各处理子叶叶绿素含量，并按公式计算出各处理叶绿素含量，即为暗培养后子叶叶绿素含量。  

五、结果计算  叶绿素含量计算公式： 

D652 × 提取液总量（ml）  叶绿素含量（mg·g－1Fw）= ——————————————  34.5 × 样品鲜重（g）  公式中：D652 — 在652nm波长下测定的吸光度值  34.5— 叶绿素a、b在652nm波长处的比吸收系数  培养后叶绿素含量  暗培养后叶绿素含量占培养前叶绿素含量（﹪）= —————————×100  培养前叶绿素含量

六、恒温培养箱、恒温水浴锅详情可咨询喆图小编。