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细胞电转染的步骤
发布时间:2018-12-03   点击次数:1122次

转染是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。电击完成后用恒温培养箱进行测试也是很关键的步骤,下面给大家介绍下电转染详细步骤。

1.清洗电转杯,将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时,然后在紫外灯下照射后即可使用。

2.电穿孔前一天,以合适密度传代细胞,使细胞在转染前出于对数生长期。对于原代培养细胞,一般培养2-3天后,细胞单层融合度可以达到70-80%,即可开始试验。

3.PBS洗细胞2次后,胰酶消化细胞2min,待细胞变圆后,用完全培养基终止消化。

4.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后,1200rpm室温离心5min。

5.完全弃去上清,根据细胞数量,加入适量的电转缓冲液重悬细胞(一般为0.5-0.6ml左右),并上下吹打均匀。

6.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度(质粒为20ug/ml,SiRNA的终浓度为100nM),上下吹打均匀。若以0.5ml计算,所需质粒为0.5×20=10ug。

7.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中,按照预定条件设置参数,进行电击操作。

8.电击完成后,将电转杯置于恒温培养箱中8-12min,以使核酸充分进入细胞。

9.将电击杯从恒温培养箱中取出,接种细胞悬液于预热的培养基中,上下吹打均匀后,置于培养箱中正常培养。

10.正常培养4h,待细胞贴壁后,给细胞换新鲜的完全培养基,以去除上层的死细胞。

11.培养24h后,即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。

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