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牛奶中β-内酰胺酶检测方法
发布时间:2019-05-08   点击次数:880次

        “无抗奶”,顾名思义,即不含抗生素的牛奶。早在2002年,这一概念便被提出,“无抗生素”的字样也登上了乳品包装。

        为何牛奶含抗生素?

        牛奶中的抗生素来自乳牛,乳牛被注射抗生素,主要是治疗乳腺发炎。乳腺炎是奶牛常见病,抗生素的使用是业内“公开的秘密”。牛奶中的抗生素可能导致饮用者过敏,或因长期接触抗生素而耐药。

        如何做到“无抗”?

        药品合理间隔期后才挤奶,可以生产无抗奶,可以通过检验抗生素的方式验证。

        1、间接法

        方法原理:利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理,向牛奶中添加一定量的青霉素,如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶,那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少,从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。

        实验步骤:称取20 g试样,在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管,并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30 min后离心,将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液(pH=8.5),涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱,用2 mL磷酸缓冲液(pH=8.5)淋洗萃取柱,再用2 mL水淋洗。MAX后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干,用0.025 M磷酸盐缓冲液(pH=7.0)定容残渣至1 mL,待上机测定。

        色谱条件:LabAlliance PC-2000液相色谱配500型紫外检测器;

          lanbo色谱柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm);

          流动相: 甲醇/0.004M 磷酸二氢钾(pH=4.5)=40/60;

          检测波长: 268 nm

        2、直接法

        方法原理:牛乳中的青霉素钾在β-内酰胺酶的作用下,主要生成青霉噻唑酸钾,并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后,可以将青霉噻唑酸钾提取出来,经液相色谱仪检测确认其是否存在,从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。

        实验步骤:称取20 g试样,在4 ℃、16000 rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管,加入无水乙醇15 mL,振荡提取30 min后离心,取清液经0.45 μm的滤膜过滤,用液相色谱仪检测。

        标准溶液配制:称取0.01 g(至0.001 g)青霉素钾于100 ml容量瓶中,加入1ml市售抗生素分解剂,室温放置2h使青霉素钾酶解完全后用去离子水定容,得到青霉噻唑酸钾标准溶液,浓度100 μg/mL。根据实际情况稀释后使用。

        色谱条件:LabAlliance PC-2000液相色谱配2000型紫外检测器;

         lanbo色谱柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm);

          流动相: 甲醇/0.004 M磷酸二氢钾(pH=4.5)=40/60;

          检测波长: 230 nm

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