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原代神经元的磁辅助转染
发布时间:2021-07-12   点击次数:130次

实验原理

 


磁转染TM 是一种新颖、简单而高效的细胞体外或体内转染方法。这项技术利用磁力来驱动结合了磁性粒子的核酸进入靶细胞,从而使细胞能在几分钟之内获得完全剂量的RNA或DNA,且各细胞获得量基本一致。NeuroMag是一个专为初级神经细胞和神经细胞系的高效率转染而设计的磁性纳米粒子配方,是神经科学研究中一种理想的转染试剂。

 

如今可以非常高效地将各类核酸如DNA、RNA或寡核苷酸转染进初级神经元和永生化神经细胞中,特别是原代海马细胞或皮质激素神经元细胞。NeuroMag兼容于血清,可以用于瞬时和稳定转染,是一种非常稳定,可应用的和仅用于研究目的技术。


实验试剂

 


1. 分离液:含0.25%D-葡萄糖的HBSS(无钙,镁),保持在4°C,现配现用。

 

 

2. 培养基:MEM中加入10%的Nu-血清,15mM的pH值7.2的HEPES,0.45%葡萄糖,1mM丙酮酸钠,2mM的L-谷氨酰胺,10 IU/ml的青-链霉素。

 

3. 营养培养基:MEM中加入2%的B27,15mM的HEPES,葡萄糖0.45%,1mM的丙酮酸钠,2mM谷氨酰胺。


实验设备

 


组织培养容器准备:

 

 

1. 将水溶性多聚L-赖氨酸(Sigma公司,P-1520)0.1 mg/mL溶于水中(分装和存储在-20°C)。

 

 

2. 将盖玻片或培养皿用多聚L-赖氨酸覆盖。

 

 

3. 37°C孵育过夜。

 

 

4. 水冲洗两次。

 

 

5. 在无菌层流罩中干燥

 


实验材料

 


海马神经元细胞或神经细胞系

 


实验步骤

 


1. 细胞

 

 

    1) 原代神经元细胞:一般来说培养了7至21天的细胞都可以进行实验,但体外培养天数(DIV)为10-15天(依据不同的培养条件)的细胞用来实验。转染前24小时更换50%的培养基。

 

 

    2) 细胞系:于转染实验的前一天准备。

 

 

2. DNA / NeuroMag复合物的制备

 

 

    1) NeuroMag:涡旋并适量加入至微管中。

 

 

    2) DNA:稀释数量的DNA至50~700微升的无血清和补充的培养基中

 

 

    3) 将上述DNA溶液加入到NeuroMag溶液中,涡旋或吹打后在室温下孵育15至20分钟。

 

 

3. 转染

 

 

    1) 将NeuroMag / DNA复合物逐滴添加到培养的细胞(细胞> 10 DIV时,生长于营养培养基中,如果<10DIV,则培养于培养基中),轻拍培养板以确保均匀分布,于15分钟内置于磁板之上。

 

 

    2) 移除磁板。

 

 

    3) 细胞在37°C 标准条件下于CO2 培养箱中培养,直到用于评价转基因表达(24小时至7天)。

 

 

    4) 方法的优化

 

 

虽然上述快速方法转染效率较高,但在特定的细胞系或原代细胞培养中,可能需要优化如下几个参数以获得最高的转染效率:核酸的剂量、NeuroMag与核酸的比例、细胞密度和孵化时间。建议您一次优化一个参数。

 

        a. 优化DNA的量

为达到最佳的转染效率,DNA的量可以增加或减少。重要的是要始终保持不断优化过程中的细胞数和培养时间。调整DNA最佳量时需要维持一个NeuroMag与DNA的固定比例(每微克DNA用3.5&mu;g的NeuroMag),在建议的范围进行调整。

        b. NeuroMag / DNA比值的优化

首先保持一个固定数量的DNA(根据您的培养皿中,细胞数量和以前的优化结果),然后在2至5&mu;L的范围内调整每微克DNA中NeuroMag的量。

        c. 细胞数量

细胞数量(密度)也是一个重要的参数,为达到良好的转染效率,根据所使用的细胞进行调整的最佳调整。合适的细胞密度取决于增长率和细胞的培养条件,同等条件下,较好的细胞融合度比低细胞密度好。

         d. 时间:

寻找转染与细胞基因活性检测,如启动子活性,表达产物等之间的孵育时间,可通过检测转染24小时后到7天之间的基因产物来监测转染效率。报告基因如绿色荧光蛋白,&beta;-半乳糖苷酶,碱性磷酸酶或荧光素酶可以用来定量测量基因表达。

    5) 共转染

在对多个质粒DNA进行共转染时,将每个质粒取相同数量进行混合,再依如上所述条件进行转染。例如,如果你有两个DNA质粒,则每质粒取1微克,再与7&mu;L的NeuroMag混合,进行实验。

    6) 共转染的选择

共转染只能实现顺序转染,而不能同时进行。因此,一个细胞在转染质粒DNA4小时至24小时以后可以与其他质粒DNA再进行转染。两步转染之间可以更换培养基。


注意事项

 


1. DNA和 NeuroMag溶液在使用前应回复至室温,并轻柔涡旋。每微克DNA使用3.5µL的NeuroMag并实验需要来进优化。

 

 

2. 神经细胞系:建议在转染前一天将细胞培养于玻片上。合适的细胞密度取决于增长率和细胞的条件。在转染期间细胞不应该少于60%的融合度(细胞覆盖生长表面的百分比)。

 

 

3. 细胞密度是实现良好的转染与低毒性的一个重要的参数,合适的细胞密度将取决于增长速度和细胞的培养条件。

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