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胚体外生产
发布时间:2021-07-12   点击次数:57次

       初生母牛的卵巢中,约含有十至三十万个卵母细胞,随着成长过程,卵巢逐渐增大,重量亦随之增加。卵母细胞的来源可以经由屠宰场取得的卵巢,采集卵巢上未成熟的卵母细胞,经体外培养使其成熟,或应用超音波扫描以观察滤泡发育状态,自活体吸取卵母细胞。

胚的体外生产系统包含:卵的体外成熟、体外受精及胚的体外培养等三大部分。早期研究体外受精技术甚为困难,一九九○年时,美国及加拿大经由体外受精生产的小牛,总数不超过一百头。

活体取卵是近十年来新发展的技术,经过不断地改善,已经有商业化的仪器与设备供应。这些设备需要超音波仪,并配备固定功率的探头,以及真空帮浦和采卵针。从超音波仪看到小滤泡时,立即将采卵针刺进小滤泡,负压作用即将滤泡液和卵母细胞吸入离心管内。母牛每周以采集两次所得的卵母细胞品质较好,数量也较多。平均每次约可收集到10个卵母细胞。

当牛只发育成长,排卵前卵子重新进行减数分裂,使核增大。滤泡成熟的过程,需经过初级、次级、三级的发育阶段,最后始成为成熟滤泡,当卵子由成熟的滤泡排出时称为排卵。

在滤泡成熟的后期,卵母细胞也逐渐成熟,细胞核亦进行减数分裂,达到第一次减数分裂中期的阶段,称为初级卵母细胞。初级卵母细胞再经一次减数分裂,即分裂为次级卵母细胞以及一个称为第一极体的较小细胞,此时达到第二次减数分裂中期。细胞分裂的过程中,当有第一极体排出时,即显示核已达到成熟,可以准备受精,这是重要的标记,利用立体显微镜即可观察到。发育成熟的次级卵母细胞,经排卵并被受精后,再继续完成其减数分裂,直到排出第二极管后才会进行一般细胞的有丝分裂,发育成为早期胚。

从屠宰场取得的卵母细胞,必须经过体外成熟阶段才能进行受精。体外成熟的培养液一般采用组织培养液如TCM199,另外再添加胎牛血清,它有促进卵子体外成熟及确保较佳的卵裂效果。

发生受精作用之前必先经过获能,这是一个非常复杂的生理变化过程。在体内受精情形下,必须先在雌性生殖道中,经过数小时的获能准备才有受精的能力;在这段期间中,发生的生理生化改变,包括去除表面附着的抗原物质,以及进行头帽反应,尤其是在头帽内至少要有四种酵素的激活和释放。欲穿过卵子的透明带,必须要靠这些酵素来溶解卵丘细胞团及透明带。

体外受精即是将已经完成获能的和成熟的卵母细胞,共同置于受精用溶液中,然后将之静置于二氧化碳培养箱中培养48小时。

受精完成并卵裂为二至四细胞的受精卵称为胚。经体外受精后的早期胚,在继续卵裂发育的过程中,会发生发育阻滞现象。不同的动物出现细胞发育阻滞的时期不同,牛羊为八至十六细胞期,猪为四细胞期,小鼠为二细胞期。因此如何克服牛的细胞发育阻滞现象,确保其发育能越过十六细胞期,是早期研究的重点。最早是利用兔子的输卵管,将受精完成并卵裂的牛胚,移入已结扎的兔子输卵管中,移植后第五天,再从兔子的输卵管回收已发育至桑椹期或囊胚期的胚,再进行胚移置到受胚牛。

目前用来克服早期胚在体外发生发育阻滞的方法,是采用细胞共培养系统。将胚与卵丘细胞、输卵管上皮细胞或子宫上皮细胞等体细胞共同培养,即可克服发育阻滞现象,使胚能继续发育,直到成为桑椹期或囊胚期,再做移置。

当母牛的生理周期与胚发育阶段不一致时,移入的胚不能顺利发育,而导致怀孕失败,因此必须利用内泌素对牛只进行处理,来调整母牛的发情周期使之同期化。其目的在使母牛于预定的时间集中发情,以便实施有计画的胚移置工作,提高受胎率。

同期发情处理应用的内分泌素有多种选择,常用的是前列腺素;其功能是当卵巢有黄体存在时,经注射前列腺素后即被消解,于是在二至三天内又能诱发一个新的发情周期,因此能掌控排卵时间及胚移置的最佳进行时机。

当新鲜胚移置时,供胚牛与受胚牛的卵巢和子宫生理状态亦必须一致,才有利于未来胚的持续发育及着床。胚在发育早期和子宫组织间尚未建立密切的关系,此一阶段的发育,基本上是依靠本身储存的养分,所以冲洗子宫后取得的胚,较易存活,一旦放回与供胚牛相似的受胚牛的子宫环境中,移置的胚即能继续发育。

供胚牛与受胚牛的发情同期化程度,差异不得超过六小时,否则会降低受胎率;也就是说,供胚牛在发情、配种后七至八天取胚,受胚牛也应在相同时间接受移置。

在大型哺乳动物采用非手术法移置技术,此技术从一九七六年以后即广泛应用于牛。牛胚移置的器材与人工授精相似,仅有口径较小与长度较长的差异而已。移置前,将胚放入胚管并且装入移置器;移置时,自生殖道插入移置器直到子宫颈外口,另一手则深入直肠找到子宫颈,缓缓配合将移置器送入子宫角内,并在预定的位置将胚注入。

 

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