如何用二氧化碳培养箱做细胞凋亡诱导试验？

【实验方法与步骤】

（1）细胞凋亡的诱导：HeLa细胞常规传代培养至对数生长期(见细胞传代培养）。实验组细胞加入顺铂溶液（生理盐水配置）至终浓度为20μmo1/L,二氧化碳培养箱设定37℃，5% CO2条件下继续培养。空白实验对照加入等体积的生理盐水，同样条件继续培养。24h后进行染色及形态学观察。      

（2）胰酶消化细胞，将培养基上清及消化下来的细胞一同转入离心管中600~800r/min离心10min。     

（3）吸去上清，用1mL PBS重悬细胞沉淀，并转入1.5mL微量离心管中，600~800r/min离心10min。    

（4）吸去上清，用500μL PBS重量细胞沉淀，取178μL转入0.5mL的微量离心管中，加入PI 20μL（终浓度100μg/mL），Hoechest 33342 2μL（终浓度10μg/mL），混匀，37℃温箱中避光标记15min。     

（5）600~800r/min离心10min，弃上清，加50μL PBS重悬细胞。    

（6）分别从实验组及对照组中取10μL细胞悬液滴于载玻片上，盖上盖玻片。     

（7）荧光显微镜20倍物镜在紫外光激发下观察，可观察到凋亡细胞核形态发生明显的改变，出现染色质凝集及边缘化。

【注意事项】       

（1）诱导细胞凋亡后收集细胞时，注意要同时收集细胞培养基上清液。   

（2）悬浮细胞时动作要轻柔，避免损伤细胞。     

（3）在实验中可同时设计坏死细胞的对照，例如，取正常细胞经低渗后进行染色观察。