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如何用二氧化碳培养箱做细胞凋亡诱导试验?

更新时间:2017-09-25  |  点击率:2082

【实验方法与步骤】

(1)细胞凋亡的诱导:HeLa细胞常规传代培养至对数生长期(见细胞传代培养)。实验组细胞加入顺铂溶液(生理盐水配置)至终浓度为20μmo1/L,二氧化碳培养箱设定37℃,5% CO2条件下继续培养。空白实验对照加入等体积的生理盐水,同样条件继续培养。24h后进行染色及形态学观察。      

(2)胰酶消化细胞,将培养基上清及消化下来的细胞一同转入离心管中600~800r/min离心10min。     

(3)吸去上清,用1mL PBS重悬细胞沉淀,并转入1.5mL微量离心管中,600~800r/min离心10min。    

(4)吸去上清,用500μL PBS重量细胞沉淀,取178μL转入0.5mL的微量离心管中,加入PI 20μL(终浓度100μg/mL),Hoechest 33342 2μL(终浓度10μg/mL),混匀,37℃温箱中避光标记15min。     

(5)600~800r/min离心10min,弃上清,加50μL PBS重悬细胞。    

(6)分别从实验组及对照组中取10μL细胞悬液滴于载玻片上,盖上盖玻片。     

(7)荧光显微镜20倍物镜在紫外光激发下观察,可观察到凋亡细胞核形态发生明显的改变,出现染色质凝集及边缘化。

【注意事项】       

(1)诱导细胞凋亡后收集细胞时,注意要同时收集细胞培养基上清液。   

(2)悬浮细胞时动作要轻柔,避免损伤细胞。     

(3)在实验中可同时设计坏死细胞的对照,例如,取正常细胞经低渗后进行染色观察。

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