实验室常用标准菌种的管理&保存

        在微生物实验室中，常需保存-些实验中常用的标准菌种及菌株，如金黄色葡萄球菌，致病性大肠杆菌，几种常见的沙门氏菌，痢疾杆菌等，以供学生进行细菌涂片染色检查、细菌接种培养、制备凝集抗原、免疫动物制备诊断血清及测定诊断血清效价等。在做抗菌药物敏感试验时，也需常备-套对各种抗菌药物“敏感”的对照菌株，使学生学会判断细菌对药物的敏感性。对这些菌种的妥善保管和保存，是良好的实验室管理和实验质量的重要保证。

        一、保管

        由于实验室中保存的菌种大多对人体具有致病性，经多次移种又易被污染和发生变异，做好安全及质量管理至关重要，主要应做到以下几点。

        1.1专人负责 菌种保管应专人负责，存放于加锁的冰箱中。保管人应具备高度的责任心，明确职责，严格执行有关的规章制度，以确保菌种安全。

        1.2详细登记 实验室应备有-本详细登记本，对各种菌种进行详细登记，内容包括菌种的名称，编号，数量，分离日期，鉴定者，细菌的形态染色，培养生化特性，抗原结构，动物致病力等，并注明使用、移种及销毁的情况和原因。

        1.3定期移种 对菌种的保管不仅要求菌种不死，还要力求其生物学性状等不发生变异。各种菌种应按规定时间定期移种。细菌在人工培养基上经数代培养后，其形态、菌落、毒力等均易发生变异，因此，在每移种3次后应做-次全面鉴定，检测菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时处理。

        二、保存

        保存菌种应根据细菌的培养特性、抵抗力等选择适合的培养基，微生物实验室常用菌种的-般保存方法有以下几种：

        2.1科面保存法

        2.1.1普通肉汤琼脂斜面：肠道杆菌、葡萄球菌等营养要求不高的细菌可接种于普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏液，以防干涸(但变形杆菌“OX”及伤寒杆菌“O’’菌株宜接种于斜面底部无肉汤的干燥的琼脂斜面，以防变异)，用橡皮塞塞紧，置37℃培养18-24h后，放于4℃冰箱中，可保存1个月，每经1个月需接种传代1次。

        2.1 .2血液琼脂斜面：链球菌及肺炎球菌的营养要求较高，在普通培养基上生长不良或不生长，应接种于血液琼脂斜面上，电热恒温培养箱37℃培养生长后，放4℃冰箱保存，链球菌需半个月-1个月接种1次;肺炎球菌因能产生自溶酶而导致自溶现象，需4d移种1次。肺炎球菌在人工培养基上经数代培养后，其形态、菌落、毒力均易发生变异，在人工培养基上肺炎球菌很快失去荚膜，经多代培养后其光滑型菌落可变为粗糙型，毒力也大为降低。

        2.1.3鸡蛋斜面：成分为新鲜全蛋、1%葡萄糖肉汤及甘油。少数沙门氏菌当新从病人检材中分离出来时，常具有Vi抗原，具有Vi抗原的细菌，有抵抗吞噬的作用，并保护细菌不被相应抗体在补体参与下所溶解，故毒力较强。含有Vi抗原的沙门氏菌等，可接种于鸡蛋斜面上，37℃培养18-24h，加无菌液体石蜡至斜面浸没，再超出约1cm，置4℃冰箱，可保存3-6个月，Vi抗原经长期人工培养，也易消失。

        2.1.4吕氏血清斜面：白喉杆菌可保存在该培养基上，其成分为l%葡萄糖肉汤(pH7 .4)1份，牛血清或兔血清(无菌)3份。白喉杆菌在此培养基上生长迅速、旺盛，菌体形态典型，如在培养基中再加人5%-10%的中性甘油，则培养出的白喉杆菌的异染颗粒更为明显，但24h后即衰老成为多形态，很少有异染颗粒，菌体粗大3-4倍，置4℃冰箱可保存2周-1个月。

        2.2半固体穿刺保存法

        2.2.1普通半固体：大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌等可穿刺接种于普通半固体培养基内，37℃培养18-24h后，加1层无菌的液体石蜡，厚度约为1cm，置4℃冰箱可保存3-6个月。传代移种时，将半固体菌种管倾斜，使液体石蜡流至-边，再取菌移种于新的培养基。将沾有少数液体石蜡的接种环浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。

        2.2.2 3.5%高盐半固体：副溶血性弧菌可保存在该培养基中，此菌适应高浓度食盐的环境，在不含食盐的培养基上不生长。培养基含食盐的浓度以3%-3.5%为MAX宜。穿刺接种后，置37℃电热恒温培养箱内培养18-24h，在室温下即可保存1个月。

        2.3罗氏培养基

        结核杆菌的营养要求较高，在培养基中需加人复杂的有机物如动物血清、鸡蛋、马铃薯、氨基酸以及磷、硫、钾、镁等无机盐类才能生长。结核杆菌的培养基种类很多，实验室MAX常用的是罗氏培养基。该菌生长速度很慢，-般分裂速度为18hl代，电热恒温培养箱37℃需培养2-3周，置4℃冰箱可保存2-3个月。

        2.4厄肉培养基

        将牛肉渣装于试管中，高约3cm，并加肉汤约srnL，比肉渣高1倍，在每管液面上加已溶化的凡士林，高约0.scm，高压灭菌后备用。破伤风杆菌等专性厌氧菌常保存在厄肉培养基内。使用时先将培养基置于水浴中煮沸10而n，以驱除管内存留的氧气，然后将破伤风杆菌接种于肉渣培养基内，经37℃培养2-7d后，培养基呈轻度均匀混浊，肉渣部分消化，微变黑，产生少量气体，4℃冰箱可保存2-3个月。

        2.5砂管保存法

        适用于有芽胞的细菌的保存，将过筛后的中性细砂烘干，装人小试管内约ICm高，橡皮塞塞紧，灭菌烘干备用。用无菌生理盐水洗下培养基上的细菌培养物，制成悬液。吸此菌液约O.smL注人砂管内，以砂土全部被浸湿为度。塞好管塞，放人干燥器内抽干。然后放在装有氯化钙(吸水剂)的干燥瓶内，置冰箱保存备用。需用菌种时，取-接种环砂土接种于适宜培养基上培养即可。

        2.6普通培养基内保存法

        将细菌的普通培养基生长物放于4℃冰箱或室温冷暗处保存。用这种方法保存，只可保存数天，久之容易变异甚至死亡。-般只作暂时保存用。