化妆品防腐挑战

        即微生物挑战性实验：将一定量的微生物加入到化妆品中，模拟化妆品中可能出现的污染情况，每隔一定时间对其中的活菌量进行检测，以活菌增减量判断化妆品防腐体系效能的实验方法。
        中和剂(neutralizer)
        在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与杀菌剂的混悬液中和微生物表面上残留的杀菌剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。
中和产物(product of neutralization)
指中和剂与杀菌剂作用后的产物。

        仪器和设备
水浴锅：48℃±2℃。 准信息平台
移液器：量程0.5yL~10L； 量程10pL~100uL； 量程100pL~1000piL及无菌吸头。
无菌吸管，10.0mL(具0.1mL刻度)或移液器及吸头。
离心机：2000g：
显微镜：
三角瓶(200mL)：
玻璃试管(18mm×180mm)：

恒温培养箱：32.5℃±2.5℃22.5℃±2.5℃.

电子天平。

生物安全柜。
计时器。
比浊仪。
涡旋振荡器。
试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。
实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。
磷酸盐缓冲液(PBS) ：0.03mmol/L， pH 8.0.
营养琼脂培养基。
沙氏琼脂培养基(SDA) 
Eug on LT 100肉汤
/E中和肉汤(Dey/Engle y中和肉汤)
改良Le the en肉汤。
        胰蛋白胨大豆琼脂(TSA) 
        试验菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538) 、大肠埃希氏菌(ATCC 25922) 、铜绿假单胞菌(ATCC15442) 、白色假丝酵母菌(ATCC 10231) 、黑曲霉菌(ATCC 16404) 。

        操作步骤

        菌液制备
        白色假丝酵母菌菌液的制备：从保存好的试管斜面上(或菌种保存管中)取适量的菌体或菌种吸附小磁珠接种于沙氏葡萄糖琼脂斜面，28℃±2℃，培养18-24h。用接种环取第1代培养物，划线接种于SDA平板， 28*℃±2℃， 电热恒温培养箱内培养18-24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落， 划线接种于SDA琼脂斜面， 28℃±2℃， 培养18-24h， 即为第3代培养物。吸取适量的无菌PBS缓冲液加入斜面试管内，反复吹洗， 洗下菌苔.将洗液转移至另一无菌试管中， 涡旋混匀20s。用PBS缓冲液将其稀释成约1.0×10°cfu/mL~1.0×10'cfu/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2h内使用， 或在2℃~8℃保存不超过24h。7.1.2铜绿假单胞菌＼金黄色葡萄球菌＼大肠杆菌菌液的制备：从保存好的试管斜面上(或菌种保存管中)取适量的菌体或菌种吸附小磁珠接种于胰蛋白胨大豆琼脂斜面，36℃±1℃，培养18-24h。用接种环取第1代培养物， 划线接种于TSA平板， 36℃±1℃℃， 培养18-24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落， 划线接种于TSA琼脂斜面， 36℃±1℃℃， 培养18-24h， 即为第3代培养物。吸取适量的无菌生理盐水加入斜面试管内，反复吹洗，洗下菌苔。将洗液转移至另一无菌试管中，涡旋混匀20s。用无菌生理盐水将其稀释成约1.0x 10'cfu/m~1.0x 10°cfu/mLL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2h内使用，或在2℃~8℃保存不超过24h。

        黑曲霉孢子悬液的制备：从保存好的试管斜面上(或菌种保存管中)取适量的菌体或菌种吸附小磁珠接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面，22.5℃±2.5℃，培养7d-11d。吸取适量的无菌0.05%(v/v)吐温
80生理盐水加入斜面试管内，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中。将孢子悬液转移至装有玻璃珠的无菌三角瓶中， 轻轻振摇1min后， 用无菌玻璃棉过滤除去菌丝。过滤后， 显微镜下(400倍) 观察悬液中是否存在菌丝， 若悬液中有菌丝存在， 可经2000g， 离心20min除去菌丝。再次在显微镜下观察， 若仍有菌丝存在， 需再次离心。用无菌0.05%(v/v) 吐温80生理盐水将其稀释成约1.0×10°cfu/mL~1.0X 10°cfu/mL的孢子悬液。制备好的孢子悬液应当天使用：或在2℃-8℃保存不超过2d， 使用前混合均匀并在显微镜下观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。

        中和剂鉴定试验
        每种试验菌株的中和剂鉴定试验应分别进行。
        化学中和剂的选择：为了中和化妆品中的防腐剂， 多采用D/E中和肉汤、Eug on LT 100液体培养基或者改良LE THE EN肉汤。若中和效果不理想， 可根据产品中添加的防腐剂类型，进行选择。化学中和剂鉴定流程
        将准备的菌液10倍系列稀释至浓度为1×10°cfu/mL的菌悬液， 用于中和鉴定试验。

        将1g或1mL样品加入到9mL中和剂中， *混匀， 室温作用30±15min， 制成中和产物：若中和效果不理想， 可用中和剂作为稀释液进行二次倍比稀释。将1mL稀释液(PBS) 加入到9mL中和剂中， *混匀， 室温作用30±15min， 作为对照组。

        分别接种1mL7.2.3.1中制备的菌液至测试管(含10mL中和产物)和对照管中，涡旋混匀。同时接种1mL 7.2.3.1中制备的菌液至10mL稀释液(PBS) 中， 作为阳性对照组。
        分别对测试组、对照组和阳性对照组进行平板计数，每个稀释度进行双平行实验。细菌培养基为TSA， 36℃±1℃， 培养48h：白色假丝酵母菌培养基为SDA， 28℃±2℃， 培养48-72h。
        对各组进行计数， 测试组计数结果记作Nvf， 对照组计数结果记作Nvn， 阳性对照组计数结果记作Nv。当Nvn接近Nv， 并且Nvf≥0.5Nvn时， 认为中和剂有效。
        其余中和方法：除化学中和剂方法外，还可采用稀释法、过滤冲洗法对产品中残留的防腐剂进行中和，具体操作方法可参照(消毒技术规范》(2002版)2.1.1.4.3。采用稀释法时，应采取适当措施补偿活菌回收率灵敏度的降低，以避免假阴性结果(例如，可采用膜过滤计数法代替稀释液平板计数法)。挑战试验
        挑战试验
        每种试验菌株的杀菌试验应分别进行。
挑战试验前应该先按照《化妆品安全技术规范》(2015版)第五章第2节“菌落总数检验方法”对样品进行“菌落总数”检测。

        接种：取0.2mL7.1中制备的菌液，加入到装有20g或20mL样品的无菌塑料瓶中，*混合均匀。接种后的样品置于22.5℃±2.5℃培养，分别在7，14，28天计数，分别计作Nx(X=7，14，28)。7.3.4计数：培养至特定时间后(7，14，21，28天)，取1mL或1g接种后的样品，加入含有9mL无菌中和剂的试管中，充分涡旋混匀。(若中和剂鉴定试验中，对样品进行百倍稀释后测定了中和剂的有效性， 则接种后的样品进行计数时也应进行百倍稀释。) 室温， 与中和剂作用30±15min后， 分别吸取1.0mL样液于2个无菌平皿中进行平板计数。如平板上生长菌落数较多，可进行10倍系列稀释，选择合适的稀释度进行平板计数。每个稀释度至少进行双平行计数。黑曲霉菌在22.5℃±2.5℃培养3-5d铜绿假单胞菌＼金黄色葡萄球菌＼大肠杆菌和白色假丝酵母菌在32.5℃±2.5℃培养48-72h。

        选取菌落数在30-300cfu(细菌和白色假丝酵母菌) 或者15-150cfu(黑曲霉) 的平板进行计数，并按照Nx=C/(Vd)计算样品中的活菌浓度(C代表计数平板上的菌落平均数：V代表计数平板上的加菌样品接种量，一般为1mL：d代表计数平板对应的稀释倍数)。

        除大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉外，还可根据产品具体情况，增加特定的试验菌，该试验菌可以代表产品MAX可能受到的生物污染。比如，在高糖分口服制剂(口腔用品) 的防腐挑战试验中， 推荐增加鲁氏接合酵母N CYC 381。