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大肠杆菌转化实验-电热恒温培养箱
发布时间:2019-05-15   点击次数:73次

        粘附在细菌细胞表面的质粒DNA在42摄氏度下经过短时间的热击处理,为DNA的吸收起到促进作用,之后于非选择培养基中培养一代,等到质粒上所带的抗菌素基因表达,就能够生长在还有抗菌素的培养基中了。以下就是大肠杆菌转化实验的具体内容。

        实验目的

        1.向大肠杆菌受体细胞内导入重组的DNA分子进行复制,增殖以及表达从而获取目的基因。

        2.对大肠杆菌的感受态细胞效果进行验证。

        3.分子生物学其他研究的使用。
 

        实验所需器材

        超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,电热恒温培养箱,制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),1.5ml微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),微量移液取样器,移液器吸头,旋涡混合器。

 

        实验所需材料和试剂

        无菌ddH2O,20%IPTG(M/V),2%X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配),培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),质粒DNA,重组DNA,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。

 

        实验操作步骤

        1.首先调节恒温水浴的温度,将其调至42℃。

        2.将一管(100μl)感受态菌由零下70℃的超低温冰柜中取出,立刻使用手指将其加温融化,然后插入冰中,对其进行5-10分钟冰浴。

        3.将10μl连接产物(通常是全部连接产物,DNA含量大于或等于100ng)加入,轻轻震荡后放置冰上20分钟。

        4.将其轻轻摇匀后插入42℃水浴中,进行90s的热休克,然后迅速放回冰中,静置3-5分钟。

        5.将900μl不含抗菌素的LB培养基分别加入到上述各管中轻轻混匀,之后再摇床的弹簧架上固定,将其在37摄氏度下震荡30-50分钟。

        6.往含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中分别滴加从超净工作台中取出的100~300μl上述转化混合液,使用经过酒精灯灼烧并且冷却后的

玻璃涂布棒进行均匀的涂布。

        7.若载体和宿主菌对于蓝白斑筛选合适的话,那么在滴完菌液后再将8μl20%IPTG,40μl2%X-gal滴加于平板上,使用经过酒精灯灼烧并且冷却后的玻璃涂布棒进行均匀的涂布。

        8.标记涂好的培养皿,先放置在37摄氏度电热恒温培养箱中30-60分钟,待表面的液体都渗透到培养基里后,再倒过来放置于37℃恒温培养箱过夜。

        9.使用酒精对被细菌污染的桌面进行消毒,写实验报告。

        10.对于平板上长出的菌落克隆进行观察,如果菌落之间能互相分开,说明实验结果好,对于白色菌斑需要特别留意。

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