大肠杆菌转化实验-电热恒温培养箱

        粘附在细菌细胞表面的质粒DNA在42摄氏度下经过短时间的热击处理，为DNA的吸收起到促进作用，之后于非选择培养基中培养一代，等到质粒上所带的抗菌素基因表达，就能够生长在还有抗菌素的培养基中了。以下就是大肠杆菌转化实验的具体内容。

        实验目的

        1.向大肠杆菌受体细胞内导入重组的DNA分子进行复制，增殖以及表达从而获取目的基因。

        2.对大肠杆菌的感受态细胞效果进行验证。

        3.分子生物学其他研究的使用。
 

        实验所需器材

        超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，电热恒温培养箱，制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），微量移液取样器，移液器吸头，旋涡混合器。

        实验所需材料和试剂

        无菌ddH2O，20%IPTG（M/V），2%X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配），培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），质粒DNA，重组DNA，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。

        实验操作步骤

        1.首先调节恒温水浴的温度，将其调至42℃。

        2.将一管（100μl）感受态菌由零下70℃的超低温冰柜中取出，立刻使用手指将其加温融化，然后插入冰中，对其进行5-10分钟冰浴。

        3.将10μl连接产物（通常是全部连接产物，DNA含量大于或等于100ng）加入，轻轻震荡后放置冰上20分钟。

        4.将其轻轻摇匀后插入42℃水浴中，进行90s的热休克，然后迅速放回冰中，静置3-5分钟。

        5.将900μl不含抗菌素的LB培养基分别加入到上述各管中轻轻混匀，之后再摇床的弹簧架上固定，将其在37摄氏度下震荡30-50分钟。

        6.往含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中分别滴加从超净工作台中取出的100~300μl上述转化混合液，使用经过酒精灯灼烧并且冷却后的

玻璃涂布棒进行均匀的涂布。

        7.若载体和宿主菌对于蓝白斑筛选合适的话，那么在滴完菌液后再将8μl20%IPTG，40μl2%X-gal滴加于平板上，使用经过酒精灯灼烧并且冷却后的玻璃涂布棒进行均匀的涂布。

        8.标记涂好的培养皿，先放置在37摄氏度电热恒温培养箱中30-60分钟，待表面的液体都渗透到培养基里后，再倒过来放置于37℃恒温培养箱过夜。

        9.使用酒精对被细菌污染的桌面进行消毒，写实验报告。

        10.对于平板上长出的菌落克隆进行观察，如果菌落之间能互相分开，说明实验结果好，对于白色菌斑需要特别留意。