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酵母感受态细胞的制备和保存
发布时间:2019-05-17   点击次数:108次

        酵母,如酿酒酵母、裂殖酵母和毕赤酵母,通常用于生物学实验研究。酵母是易于培养的单细胞真核生物,他们的基因和蛋白质与哺乳动物具有很好的相似性,所以是优秀的生物模型。

        酵母细胞用于研究基因功能,蛋白质相互作用,细胞通路等,也是大规模异源蛋白表达和小分子生产的卓越宿主,在发酵,酿造和制药行业等起着中流砥柱的作用。涉及酵母的常见的实验有酵母双/三杂交系统,突变体筛选库和同源重组,等等。

        一、为什么我们需要酵母感受态细胞?

        通常,在实验过程中需外源DNA引入到酵母细胞。引入基因片段(线性ssDNA或质粒)是通过酵母细胞的转化来实现的,具体方法有化学法,如醋酸锂和聚乙二醇(PEG)或电穿孔法。有效的酵母转化需要高质量的酵母感受态细胞为开始。胜任力则是指细胞能吸收游离的细胞外的遗传物质(如质粒DNA)的能力。

        二、酵母感受态细胞的制备 

        获得感受态细胞相当简单,但许多研究人员在实现良好的生存比例和转换效率时  遇到问题。常见的误区包括由于制备条件恶劣导致高的细胞死亡率,或由于无效的感受态细胞制备导致转化效率低。

        虽然酵母细胞和大肠杆菌一样容易生长和转化,但它们需要不同的处理方法来制备感受态细胞和转化。酵母细胞像哺乳动物细胞一样,有类似的处理程序。典型的酵母感受态细胞制备协议如下:

  1. 过夜培养你想转化的酵母菌菌株,使用营养丰富的培养基培养不含质粒的细胞。对于已经含有质粒的细胞,使用适当的选择性培养基来维持质粒。
  2. 当细胞密度达到1 - 2 x 107cells/mL,离心收获细胞。细胞密度可以通过使用分光光度计在OD600检测,或者使用血球计在显微镜下计数细胞。
  3. 冲洗细胞,重悬于无菌水,离心,弃上清,重复此步骤两次以彻底清洗细胞。
  4. MAX后一次洗完,将细胞重悬于感受态细胞溶液,分装,大约每管108个细胞,每个转化反应将使用这些数量的细胞。分装好的管子放于-80°C,供以后实验使用。
  5. 在所有步骤中,使用质量好的无菌过滤器消毒过的试剂,以防止污染问题。

        感受态细胞溶液包含合适浓度的冷冻保护剂,这些浓度应该在你的实验室标准化,根据使用的酵母菌株和细胞的浓度。标准协议使用5%的甘油 + 10% DMSO溶液混合,这种配方被广泛应用来制备感受它细胞,也可根据具体情况进行轻微的改变或调整。

        关于冷冻保护剂

        甘油和二甲亚砜(DMSO)是MAX常见的细胞可透过性冷冻保护剂,用于准备感受态细胞。它们穿透细胞,防止冰晶的形成,冰晶可能会在冻结过程中导致膜破裂。甘油和DMSO也有一定的缺点,他们可能会导致细胞毒性,特别是在解冻过程中。非细胞透过性的试剂如蔗糖和海藻糖等也可用于替代物。山梨糖醇钙也是一个好的冷冻保护剂,尤其适用于电穿孔制备感受态细胞。

        三、酵母感受态细胞的储存

        每次转化时使用新鲜的感受态细胞是明智的,因为长时间储存,转化效率会降低,但这并不总是可行的。

        感受态细胞可以存储在-80°C长达一年,没有转化潜能的损失。然而, 瞬间冻结在液氮或-80°C冰箱是不建议的。感受态细胞需要在冷冻保护剂中,像哺乳动物细胞一样缓慢地冷冻。

  1. 使用硬纸板或聚苯乙烯泡沫塑料盒等储存。
  2. 用纸片等将盒子里的细胞管隔开,分成多个小格子。
  3. 复苏过程中,在电热恒温培养箱37°C解冻细胞,转化前用丰富培养基清洗防冻剂。

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