肥料中粪大肠菌群的测定

         1　范围
    本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。

         2　定义
    粪大肠菌群  fecal coliforms系指一群在隔水式恒温培养箱44.5℃±0.5℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的MAX可能数（MPN）。

         3　设备和材料
    •　高压蒸汽灭菌器。
    •　显微镜。
    •　恒温水浴或隔水式培养箱。
    •　恒温旋转式摇床。
    •　鼓风干燥箱。
    •　天平。
    •　酸度计或精密pH 试纸。
    •　接种环。
    •　试管（15mm×150mm）。
    •　小套管（杜兰管）。
    •　移液管。
    •　三角瓶。
    •　培养皿。
    •　载玻片。
    •　玻璃珠。
    •　酒精灯。
    •　试管架。

         4　培养基和试剂
         4.1　培养基：遵照附录A的规定。
         4.2　革兰氏染色液：遵照附录B的规定。

         5　检验步骤
         5.1　样品稀释
    在无菌操作下称取样品10.0g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液。
    用无菌移液管吸取5.0 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。

         5.2　乳糖发酵试验
    选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液1.0mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置44.5℃±0.5℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按5.3进行。

         5.3　分离培养
从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。

         5.4　证实试验
         从5.3分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置44.5℃±0.5℃条件下培养24h ±2h。观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。

         5.5　结果
         证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。