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乳酸脱氢酶(LDH)释放法

更新时间:2021-07-13  |  点击率:1928

1)测定方法

1.用含5%小牛血清的RPMI-1640培养液将靶细胞调整到5×104~2×105/ml,此浓度需根据情况预先标定。

2.在96孔圆底细胞培养板中加入靶细胞,每孔加100μl。3个效应细胞自然释放对照孔不加靶细胞,只加100μl培养液。

3.向各孔加100μl效应细胞,效应细胞与靶细胞的比例根据要求而定,通常为5:1~20:1。自然释放孔不加效应细胞只加100μl培养液,最大释放孔中加100μl 1% NP40。每个实验置三个复孔。

4.置37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养4~6小时。

5.离心培养板200×g 10分钟。每孔吸出150μl上清液,对应加入另一块96孔酶联检测板中。向第二块板每孔依次加20μl 0.4mol/L乳酸溶液、20μl 4mmol/L 2-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑,20μl反应液(含0.03% BSA,2.7U/ml硫辛酰胺脱氢酶,4.5mmol/L氢化型辅酶I(NAD+),1.2%蔗糖的PBS),室温中放置20分钟。

6.在酶联检测仪上测定各孔的光密度(OD值),检测波长492nm,参考波长650nm。

2)特异性杀伤活性的计算

杀伤活性(%)=[(OD实验组-OD总自然释放)/(OD最大释放组-OD总自然释放)]×100%


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