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怎么用恒温培养箱进行初代细胞培养实验?

更新时间:2017-08-30  |  点击率:910

细胞初代培养或原代培养,是从供体获取组织后的培养。其zui大优点是:组织和细胞刚刚离体,生物性状尚未发生很大的变化,具有二倍体遗传性状,在供体来源充分、生物条件稳定的情况下(年龄、性别),在一定程度上能反映体内状态。

实验方法原理:      

合成培养基胰蛋白酶消化培养法,能把组织块分散成细胞团或单个细胞,便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物,细胞能较快地长成单层。

本法尤适用于培养大量组织,细胞产量高;但用于经常性小量培养工作稍显繁琐,无菌操作不良时且易污染。

实验材料:试剂、试剂盒 Hanks、培养液、胰蛋白酶

仪器、耗材:吸管、平皿、培养瓶、烧杯、搅拌器、三角烧瓶、不锈钢筛、眼科剪、眼科镊、计数板

实验步骤:       

1.  准备

取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20 分钟;

2.  布局

点燃酒精灯(或煤气灯),安装吸管帽(应通过火焰);

3.  处理组织

把组织块置入烧杯中,用Hanks液漂洗2~3 次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60 分钟;

4.  剪切

用眼科剪把组织块切成2~3 毫米大小的块(用手术刀割亦可),以便于消化;加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞;

5.  消化

或用恒温水浴,或置入37 ℃电热恒温培养箱消化均可,消化中每隔20 分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好(消化前瓶中需置一无菌搅棒);消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定;

6.  分离

在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块(必要时可继续进行消化);低速(500~1000 转/分)离心消化液5 分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液(如有其它酶或EDTA 等消化,需用Hanks液洗脱一两次后,再加入培养液);

7.  计数

用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中;对大多数细胞来说,pH 要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说胆液体变酸,可用NaHCO3调整;

8.  培养

置入36.5 ℃温箱培养;如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需更换新塞。

注意事项:   

1.  组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品,在培养时再携入操作野;如预先置入,需用纸张覆盖,以免受射线影响;开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部(工作时宜挽上袖口)。

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